Quantifizierung von minimaler Resterkrankung bei akuter myeloischer Leukämie mit NPM1-Mutation mittels Real-Time-PCR:
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2011
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1
EINLEITUNG
1
1.1
DIE
AKUTE
MYELOISCHE
LEUKAEMIE
1
1.2
NUCLEOPHOSMIN
3
1.2.1
STRUKTUR
DESNPM
GENS
UND
PROTEINS
3
1.2.2
EXPRESSION
UND
FUNKTIONEN
DES
NPM
PROTEINS
4
1.2.3
ENTDECKUNG
VON
NPM1
MUTATIONEN
BEI
AML
5
1.2.4
NACHWEIS
DER
NPM1
MUTATIONEN
6
1.2.4.1
AUFTRETEN
VON
NPM1
MUTATIONEN
6
1.2.4.2
TYPEN,
HAEUFIGKEIT
UND
STABILITAET
VON
NPM1
MUTATIONEN
6
1.2.4.3
ZUSAMMENHANG
ZWISCHEN
NPM1
MUTATIONEN,
KARYOTYP
UND
ANDEREN
MUTATIONEN
8
1.2.5
NUKLEO-ZYTOPLASMATISCHER
TRANSPORT
VON
WILDTYP-NPM
9
1.2.6
VERAENDERTER
NUKLEO-ZYTOPLASMATISCHER
TRANSPORT
VON
NUCLEOPHOSMIN
IN
NPMC+AML
9
1.2.7
MOEGLICHE
ROLLE
VON
NPM
MUTANTEN
BEI
DER
ENTSTEHUNG
VON
LEUKAEMIEN
9
1.2.8
PATHOLOGISCHE
UND
KLINISCHE
EIGENSCHAFTEN
VON
NPMC+
AML
10
1.2.9
KLINISCHE
BEDEUTUNG
VON
NPM1
MUTATIONEN
11
1.2.9.1
ANSPRECHEN
AUF
THERAPIE
UND
PROGNOSTISCHER
WERT
VON
NPM1
MUTATIONEN
11
1.2.9.2
UEBERWACHUNG
VON
MINIMALER
RESTERKRANKUNG
12
2
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
14
3
MATERIAL
UND
METHODEN
16
3.1
MATERIALIEN
16
3.1.1
OLIGONUKLEOTIDE
16
3.1.2
ZELLLINIEN
17
3.1.2.1
OCI/AML3
17
3.1.2.2
NMP1
A
NEGATIVE
ZELLLINIEN
17
3.1.3
BLUT
UND
KNOCHENMARKPROBEN
17
3.1.4
CHEMIKALIEN
UND
KITS
20
3.1.5
LABORAUSSTATTUNG
21
3.1.6
SOFTWARE
22
3.2
METHODEN
22
3.2.1
ZELLKULTUR
22
3.2.2
ISOLIERUNG
VON
MONONUKLEAEREN
ZELLEN
23
3.2.3
RNA
PRAEPARATION
23
3.2.3.1
RNA-ISOLIERUNG
AUS
PATIENTENPROBEN
23
3.2.3.2
RNA-ISOLIERUNG
AUS
ZELLEN
24
3.2.4
CDNA-SYNTHESE
24
3.2.5
REAL-TIME-PCR
25
3.2.5.1
DETEKTION
DER
PCR-PRODUKTE
26
3.2.5.2
RELATIVE
QUANTIFIZIERUNG
IM
LIGHTCYCLER
27
IV
3.2.6
MUTATIONSANALYSE
MITTELS
SCHMELZKURVEN-PCR
30
3.2.7
GELELEKTROPHORESE
32
4
ERGEBNISSE
33
4.1
CDNA
ALS
AUS
OCI/AML3
ZELLEN
ALS
POSITIVKONTROLLE
33
4.2
ETABLIERUNG
EINER
REAL-TIME
PCR
(RQ-PCR)
FUER
DIE
QUANTITATIVE
BESTIMMUNG
VON
NPM1
TYP
A
33
4.2.1
PRINZIP
DER
RELATIVEN
QUANTIFIZIERUNG
33
4.2.2
NORMALISIERUNG
UEBER
EINEN
CALIBRATOR
33
4.2.3
ERMITTLUNG
DER
PRIMER-PAARE
UND
SONDEN
34
4.2.4
PROGRAMMIERUNG
LIGHTCYCLER
35
4.2.5
OPTIMIERUNG
DER
PCR-BEDINGUNGEN
FUER
NPM1
TYP
A
35
4.2.6
ETABLIERUNG
DER
PCR
FUER
DAS
REFERENZGEN
ABL1
37
4.2.7
ERSTELLEN
DER
STANDARDKURVEN
FUER
DIE
RELATIVE
QUANTIFIZIERUNG
37
4.2.8
SENSITIVITAET
UND
SPEZIFITAET
IN
ZELLLINIEN
40
4.2.9
ETABLIERUNG
DES
TESTS
MIT
PATIENTENPROBEN
41
4.2.10
REPRODUZIERBARKEIT
42
4.3
AUSWERTUNG
DER
RQ-PCR-DATEN
MITHILFE
DER
LC
SW
4.05
43
4.3.1
DATENTRANSFER
IN
SW
4.05
43
4.3.2
QUANTIFIZIERUNGSANALYSE
43
4.3.3
EFFIZIENZKORREKTUR
44
4.4
ANWENDUNG
DER
RQ-PCR
AUF
PATIENTENPROBEN
46
4.4.1
MRD
MONITORING
MIT
AUSGEWAEHLTEN
PATIENTENPROBEN
46
4.4.1.1
CHARAKTERISIERUNG
DER
VERWENDETEN
PATIENTENPROBEN
46
4.4.1.2
VERGLEICH
VON
PROBEN
ZU
UNTERSCHIEDLICHEN
ZEITPUNKTEN
DER
ERKRANKUNG
46
4.4.1.3
FALLBEISPIELE
47
4.4.2
STABILITAET
DERNPML
MUTATION
51
5
DISKUSSION
52
5.1
NPM1A
RQ-PCR
52
5.1.1
VERGLEICH
ONE-STEP
ZU
TWO-STEP
RT-PCR
52
5.1.2
VERGLEICH
VON
LIGHTCYCLER
UND
ABI
PRISM
7700
SDS
53
5.1.3
HYDROLYSESONDEN
IM
VERGLEICH
MIT
ANDEREN
DETEKTIONSSYSTEMEN
53
5.1.4
WAHL
DES
REFERENZGENS
54
5.1.5
NORMALISIERUNG
55
5.1.6
SENSITIVITAET
57
5.1.7
SPEZIFITAET
57
5.1.8
REPRODUZIERBARKEIT
58
5.1.9
ALTERNATIVEN
ZUR
RQ-PCR
60
5.1.10
VERGLEICH
DER
NPM1
A
RQ-PCR
MIT
ANDEREN
ARBEITEN
60
5.2
UEBERTRAGUNG
DER
ERGEBNISSE
DER
OCI/AML3
ZELLEN
AUF
PATIENTENPROBEN
62
5.2.1
DATENAUSWERTUNG
DER
PATIENTENPROBEN
62
5.2.2
ERGEBNISSE
BEI
BEISPIELPATIENTEN
63
V
5.3
VERWENDUNG
VON
PERIPHEREM
BLUT
ALS
MATERIAL
FUER
DIE
RQ-PCR
63
5.4
PROGNOSESCHAETZUNG
MITHILFE
NPM1
65
5.5
NPM1
ALS
MRD-MARKER
65
5.6
AUSBLICK
67
5.6.1
REPRODUZIERBARKEIT
UND
STABILITAET
67
5.6.2
NPM1
MUTATIONEN
TYP
B
UND
D
67
5.6.3
KLASSIFIKATION
VON
AML
MITHILFE
VON
GENEXPRESSIONSPROFILEN
68
5.6.4
KLASSIFIKATIONEN
FUER
AML
MIT
NORMALEM
KARYOTYP
68
6
ZUSAMMENFASSUNG
70
7
ABSTRACT
72
8
LITERATURVERZEICHNIS
73
9
ANHANG
80
9.1
DANKSAGUNG
80
9.2
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
81
9.3
CURRICULUM
VITAE
84
|
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