Genomweite Analyse von intraviralen Proteininteraktionen bei Epstein-Barr-Virus (EBV):
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[Kraiburg]
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2010
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| adam_text | Titel: Genomweite Analyse von intraviralen Proteininteraktionen bei Epstein-Barr-Virus (EBV)
Autor: Kraus, Theo Franz Josef
Jahr: 2010
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung..........................................................................................1
2 Einleitung.......................................................................................................5
2.1 Herpesviren.....................................................................................................5
2.1.1 Überblick........................................................................................................5
2.1.2 Aufbau............................................................................................................6
2.1.3 Replikation und Lebenszyklus der Herpesviren.............................................8
2.2 Das Epstein-Barr-Virus..................................................................................9
2.2.1 Geschichte des Epstein-Barr-Virus................................................................9
2.2.2 Die Infektion mit EBV.................................................................................10
2.2.3 EBV-assoziierte Erkrankungen....................................................................11
2.2.3.1 Mononucleosis infectiosa.............................................................................11
2.2.3.2 X-linked-lymphoproliferatives-Syndrom.....................................................12
2.2.3.3 Chronisch-aktive EBV-Infektion..................................................................13
2.2.3.4 Burkitt-Lymphom.........................................................................................13
2.2.3.5 Hodgkin-Lymphom......................................................................................14
2.2.3.6 Nasopharynxkarzinom..................................................................................15
2.2.3.7 Lymphoepithelioma-ähnliches Magenkarzinom..........................................17
2.2.3.8 EBV-assoziierte lymphoepitheliale Karzinome der Speicheldrüsen............17
2.2.3.9 Weitere mit EBV assoziierte Erkrankungen.................................................18
2.2.4 DasEBV-Genom..........................................................................................19
2.2.5 Nomenklatur der Virusproteine....................................................................21
2.2.6 Die zwei viralen Reproduktionsphasen........................................................22
2.2.6.1 Latenter Zyklus.............................................................................................23
2.2.6.2 Lytischer Zyklus...........................................................................................25
2.3 Ziele der Arbeit.............................................................................................27
3 Material und Methoden................................................................................29
3.1 Material.........................................................................................................29
3.1.1 Geräte............................................................................................................29
3.1.2 Chemikalien..................................................................................................30
3.1.3 Zusätzliches Material....................................................................................32
3.1.4 Bakterien.......................................................................................................33
3.1.5 Viren.............................................................................................................33
3.1.6 Hefe..............................................................................................................33
m
Inhalts verzeichni s
3.1.7 Zelllinien.......................................................................................................33
3.1.8 Plasmide.......................................................................................................33
3.1.9 Oligonukleotide............................................................................................34
3.1.9.1 Gateway-Primer............................................................................................34
3.1.9.2 Sequenzierungsprimer..................................................................................34
3.1.9.3 EBV-spezifische Primer...............................................................................34
3.1.10 Molekulare Größenmarker...........................................................................34
3.1.10.1 DNA-Größenmarker.....................................................................................34
3.1.10.2 Protein-Größenmarker..................................................................................34
3.1.11 Kits...............................................................................................................34
3.1.12 Enzyme.........................................................................................................35
3.1.13 Antikörper.....................................................................................................35
3.1.13.1 Primäre Antikörper.......................................................................................35
3.1.13.2 Sekundäre Antikörper...................................................................................35
3.2 Methoden......................................................................................................36
3.2.1 Kultur von Bakterien....................................................................................36
3.2.1.1 Kultivierung von Bakterien..........................................................................36
3.2.1.2 Herstellung kompetenter E. coli...................................................................36
3.2.1.3 Transformation von Bakterien......................................................................36
3.2.1.3.1 Transformation mittels Elektroporation.......................................................36
3.2.1.3.2 Chemische Transformation...........................................................................37
3.2.1.4 Herstellung von Glycerin-Kulturen..............................................................37
3.2.2 Methoden zur Isolation, Aufreinigung und Analyse von DNA....................37
3.2.2.1 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR).............................................................37
3.2.2.1.1 Amplifizierungs-PCR...................................................................................37
3.2.2.1.2 Sequenzierungs-PCR....................................................................................40
3.2.2.2 Nachweis der DNA-Fragmente....................................................................40
3.2.2.3 Aufreinigung der DNA-Fragmente..............................................................41
3.2.2.4 Recombinational Cloning.............................................................................41
3.2.2.4.1 BP-Reaktion.................................................................................................42
3.2.2.4.2 LR-Reaktion.................................................................................................42
3.2.2.5 Plasmid-DNA-Präparation...........................................................................43
3.2.2.5.1 Mini -Plasmid-DNA-Präparation...............................................................43
3.2.2.5.2 Maxi -Plasmid-DNA-Präparation..............................................................43
IV
Inhaltsverzeichnis
3.2.2.6 Restriktionsverdau........................................................................................44
3.2.2.7 Photometrische DNA-Konzentrationsmessung............................................44
3.2.3 Hefekultivierung...........................................................................................45
3.2.3.1 Das Yeast-2-Hybrid-Verfahren....................................................................45
3.2.3.2 Herstellung kompetenter Hefe......................................................................48
3.2.3.3 Transformation von Vektor-DNA in Hefe...................................................48
3.2.3.4 Hefe-Paarung und Selektion im Yeast-2-Hybrid-Verfahren (Y2H).............48
3.2.3.5 3AT-Autoaktivierungstest............................................................................50
3.2.3.6 Herstellung von Hefe-Glycerinkulturen.......................................................51
3.2.4 Zellbiologische Methoden............................................................................51
3.2.4.1 Kultivierung humaner Zellen........................................................................51
3.2.4.1.1 HEK293 und HeLa.......................................................................................51
3.2.4.1.2 BJAB, DG75, IHE, RAJI.............................................................................51
3.2.4.2 Kryokonservierung.......................................................................................51
3.2.4.3 Calzium-Phosphat-Transfektion...................................................................52
3.2.4.4 DNA-Isolation aus EBV-positiven Zellen....................................................52
3.2.4.5 Immunfluoreszenz........................................................................................53
3.2.5 Proteinchemische Methoden.........................................................................54
3.2.5.1 Koimmunopräzipitation................................................................................54
3.2.5.2 SDS-PAGE...................................................................................................55
3.2.5.3 Westernblot / Immunoblot............................................................................55
4 Ergebnisse.....................................................................................................57
4.1 Herstellung eines EBV-Prey- und -Bait-Vektorsatzes.................................57
4.1.1 Amplifizierung des EBV-ORFeoms.............................................................57
4.1.2 Klonierung von attB-Sites an die PCR-Produkte.........................................59
4.1.3 Erstellung eines EBV- Entry -Vektorsatzes................................................61
4.1.4 Erstellung eines EBV- Destination -Vektorsatzes......................................61
4.1.5 Berücksichtigung der Sequenzierungsergebnisse.........................................62
4.2 Erstellung funktionierender Hefe-Bibliotheken...........................................65
4.2.1 Hefetransformation.......................................................................................65
4.2.2 Durchfuhrung des Yeast-2-Hybrid-Screenings............................................65
4.2.3 Reduktion der Fehlertoleranz des Y2H-Systems.........................................67
4.3 Protein-Proteininteraktionsnetzwerk mittels Y2H-Screening-Ergebnissen . 69
4.4 Bestätigung der Interaktionen mittels Koimmunopräzipitation...................72
Inhaltsverzeichnis
4.5 Das Interaktom des Epstein-Barr-Virus.......................................................74
4.6 Fokussierung auf bedeutende Teilnetzwerke...............................................76
4.6.1 Die Transkriptionsaktivatoren BZLF1 undBRLFl.....................................76
4.6.2 Die Gruppe der Hauptlatenzproteine............................................................79
4.6.3 Die viralen Glykoproteine............................................................................81
4.7 Inter-Herpesvirus-Vergleich.........................................................................82
5 Diskussion....................................................................................................89
5.1 Das Epstein-Barr-Virus-Interaktom.............................................................89
5.1.1 Proteininteraktionsnetzwerke als Meilenstein zukünftiger Therapien.........89
5.1.2 Auswahl der viralen Proteine.......................................................................89
5.1.3 DNA-Templates und ihre Aufbereitung.......................................................90
5.1.4 Das Yeast-2-Hybrid-System.........................................................................92
5.1.5 Kontrolle der Y2H-Ergebnisse mittels Koimmunopräzipitation..................94
5.2 Aufschlüsselung des EBV-Proteoms............................................................95
5.3 Bioanalytische Betrachtung des Epstein-Barr-Virus-Interaktoms.............100
5.4 Erweiterung von Teilnetzwerken anhand vorbeschriebener Interaktionen 105
5.4.1 Erweiterung des Transkriptionsaktivatorennetzwerkes..............................106
5.4.2 Die strong Hubs BALF4 und BFRF4.........................................................107
5.4.3 Das BLLF2-Protein....................................................................................110
5.5 Bedeutung isolatspezifisch-deletierter Proteine.........................................112
5.6 Virus-Wirts-Netzwerk................................................................................118
5.7 Interherpesvirusvergleich des Epstein-Barr-Virus-Interaktoms.................123
5.8 Erweiterung des EBV-Interaktoms anhand von Orthologiedaten..............126
5.9 Ausblick......................................................................................................132
6 Bibliografie.................................................................................................133
7 Anhang.......................................................................................................161
7.1 Übersicht der Abbildungen, Diagramme und Tabellen..............................161
7.2 Abkürzungen..............................................................................................164
7.3 Stammlösungen..........................................................................................167
7.4 Primerliste...................................................................................................170
7.5 Interaktionen...............................................................................................175
7.6 Proteinfunktionen und Orthologievergleich...............................................177
8 Danksagung................................................................................................179
9 Curriculum Vitae........................................................................................181
VI
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