Verfügbarkeit: Die Generierung der Slack-knockout-Maus mit konstitutiver und konditionaler Gendeletion

Die Generierung der Slack-knockout-Maus mit konstitutiver und konditionaler Gendeletion:

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser:	Bausch, Anne 1980- (VerfasserIn)
Format:	Abschlussarbeit Buch
Sprache:	German
Veröffentlicht:	2010
Schlagworte:	Hochschulschrift
Online-Zugang:	Inhaltsverzeichnis
Beschreibung:	VII, 168 S. Ill., graph. Darst. 21 cm

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adam_text	INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS ................................................................................................................... I ABBILDUNGSVERZEICHNIS ....................................................................................................... IV TABELLENVERZEICHNIS ................................................................................................. V ABKUERZUNGSVERZEICHNIS ...................................................................................................... VI 1 EINLEITUNG ............................................................................................................................. 1 1.1 LONENKANAELE ....................................................................................................................... 1 1.2 KALIUMKANAELE .................................................................................................................... 2 1.3 KALIUMKANAELE DER SLO-GENFAMILIE .................................................................................... 5 1.3.1 SLO1 (BK-KANAL) ........................................................................................................ 5 1.3.2 SLO2 (SLICK (SIO2.1) UND SLACK (SLO2.2)) ................................................................... 6 1.3.3 SLO3 ............................................................................................................................ 8 1.4 SLACK UND SLICK: EIGENSCHAFTEN UND FUNKTION .................................................................. 8 1.4.1 MOLEKULARE EIGENSCHAFTEN UND FUNKTIONELLE DOMAENEN ............................................. 8 1.4.2 ELEKTROPHYSIOLOGISCHE EIGENSCHAFTEN VON SLICK (SLO2.1) ......................................... 11 1.4.3 ELEKTROPHYSIOLOGISCHE EIGENSCHAFTEN VON SLACK (SLO2.2) ....................................... 11 1.4.4 EXPRESSIONSMUSTER .................................................................................................. 12 1.4.5 POTENTIELLE BIOLOGISCHE FUNKTION .............................................................................. 13 1.5 GEZIELTE INAKTIVIERUNG VON GENEN IN EMBRYONALEN STAMMZELLEN .................................. 21 1.5.1 EMBRYONALE STAMMZELLEN (ES-ZELLEN) DER MAUS ................................................... 21 1.5.2 HOMOLOGE REKOMBINATION IN ES-ZELLEN ................................................................. 22 1.5.3 CRE-LOXP-SYSTEM ..................................................................................................... 24 2 FRAGESTELLUNG UND ZIELSETZUNG ............................................................................28 3 MATERIAL .............................................................................................................................29 3.1 GERAETE .............................................................................................................................. 29 3.2 VERBRAUCHSMATERIALIEN .................................................................................................... 30 3.3 CHEMIKALIEN ..................................................................................................................... 32 3.3.1 STANDARDCHEMIKALIEN ............................................................................................... 32 3.3.2 RADIOCHEMIKALIEN .................................................................................................... 33 3.3.3 NUKLEINSAEUREN .......................................................................................................... 33 3.4 OLIGONUKLEOTIDE ................................................................................................................ 33 3.5 IMAGENES LIBRARIES UND KLONE ....................................................................................... 35 3.6 PLASMIDE .......................................................................................................................... 35 3.7 ENZYME ............................................................................................................................ 36 3.7.1 RESTRIKTIONSENZYME .................................................................................................36 3.7.2 SONSTIGE ENZYME .....................................................................................................37 3.8 BAKTERIENSTAEMME .............................................................................................................37 3.9 MAUSLINIEN ........................................................................................................................ 37 3.10 KIT-SYSTEME ..................................................................................................................... 38 3.11 PUFFER UND LOESUNGEN FUER DIE MOLEKULARBIOLOGIE .............................................................. 38 3.11.1 ALLGEMEIN ................................................................................................................. 38 3.11.2 GELELEKTROPHORESE ................................................................................................... 39 3.11.3 SOUTHERNBLOT ................................................ 39 3.11.4 SOUTHERNBLOTHYBRIDISIERUNG ...................................................................................... 39 3.12 KULTURMEDIEN UND ZUSAETZE FUER DIE BAKTERIENKULTUR ........................................................ 40 3.12.1 KULTURMEDIEN UND AUSGANGSLOESUNGEN .....................................................................40 3.12.2 ANTIBIOTIKAZUSAETZE .................................................................................................... 41 3.13 LOESUNGEN, KULTURMEDIEN UND ZUSAETZE FUER DIE KULTUR EUKARYOTISCHER ZELLEN ................. 42 4 METHODEN ............................................................................................................................ 46 4.1 BAKTERIENKULTUR ................................................................................................................. 46 4.1.1 PLATTENKULTUREN .......................................................................................................... 46 4.1.2 FLUESSIGKULTUREN ..........................................................................................................46 4.1.3 LANGZEITLAGERUNG VON KLONEN .................................................................................. 46 4.1.4 MESSUNG DER OD 60 O ................................................................................................... 47 4.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN ......................................................................................47 4.2.1 ALKOHOLFAELLUNG VON DNA ........................................................................................... 47 4.2.2 REINIGUNG VON DNA .................................................................................................. 48 4.2.3 GELELEKTROPHORESE VON DNA ....................................................................................49 4.2.4 ISOLIERUNG EINZELNER DNA-FRAGMENTE AUS AGAROSEGELEN ....................................... 50 4.2.5 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEURELOESUNGEN ........................................ 51 4.2.6 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) .......................................................................... 51 4.2.7 RESTRIKTIONSVERDAU .................................................................................................... 53 4.2.8 DEPHOSPHORYLIEREN VON DNA ................................................................................... 54 4.2.9 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN ................................................................................ 55 4.2.10 TRANSFORMATION (BLAU-WEISS-SELEKTION) .................................................................... 55 4.2.11 GENERIERUNG NEUER SCHNITTSTELLEN IN PLASMIDEN .....................................................56 4.2.12 KLONIERUNG VON PCR-PRODUKTEN .............................................................................. 57 4.2.13 KLONIERUNG VON BAC-FRAGMENTEN ............................................................................ 58 4.2.14 DURCHFUEHRUNG EINES STANDARD-KLONIERUNGSSCHRITTES ............................................... 58 4.2.15 GEWINNUNG VON PLASMID DNA ................................................................................. 59 4.2.16 GEWINNUNG VON BAC-DNA .......................................................................................60 4.2.17 ISOLIERUNG VON GENOMISCHER DNA ............................................................................ 61 4.2.18 ANALYSE VON DNA MITTELS SOUTHERNBLOT .................................................................... 62 4.2.19 SEQUENZIERUNG VON DNA ......................................................................................... 65 4.2.20 SCREENING EINER GENBIBLIOTHEK ............................................................. 66 4.3 METHODEN ZUR GEZIELTEN INAKTIVIERUNG VON GENEN IN EMBRYONALEN STAMMZELLEN DER MAUS ................................................................................................................................67 4.3.1 GENERELLE ASPEKTE DER KULTUR VON EMBRYONALEN STAMMZELLEN .............................. 67 4.3.2 KULTURBEDINGUNGEN FUER EMBRYONALE STAMMZELLEN .................................................. 67 4.3.3 GEFAESSE FUER DIE ZELLKULTUR .......................................................................................... 69 4.3.4 GEWINNUNG UND KULTIVIERUNG EMBRYONALER FIBROBLASTENZELLEN (FEEDERZELLEN).... 69 4.3.5 GENETARGETING .......................................................................................................... 71 4.3.6 AUFTAUEN UND AUSSAEEN VON EMBRYONALEN STAMMZELLEN ........................................77 4.3.7 PASSAGIEREN VON ES-ZELLEN .................................................................................... 78 4.3.8 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL ......................................................................................... 79 4.3.9 ELEKTROPORATION ......................................................................................................... 79 4.3.10 ISOLIERUNG EINZELNER ES-ZELLKLONE: .......................................................................... 81 4.3.11 EVALUATION DES WACHSTUM DER ES-ZELLEN NACH DER ISOLIERUNG IN 96 WELL PLATTEN 83 4.3.12 VERVIELFAELTIGUNG DER DNA-ANALYSENPLATTE (PLATTE B) FUER DIE SOUTHERNBLOT NACHWEISE ...............................................................................................................84 4.3.13 EINFRIEREN VON ES-ZELLEN ......................................................................................... 84 4.3.14 VORBEREITEN DER ES-ZELLEN FUER DIE BLASTOZYSTENINJEKTION ..................................... 85 4.4 GENERIERUNG VON CHIMAEREN UND TESTUNG AUF KEIMBAHNGAENGIGKEIT ............................ 86 4.4.1 BLASTOZYSTENINJEKTION UND -REIMPLANTATION ............................................................. 86 4.4.2 TEST AUF KEIMBAHNGAENGIGKEIT ................................................................................. 88 4.5 METHODEN DER MAUSZUCHT ............................................................................................... 89 4.5.1 TIERHALTUNG ............................................................................................................... 89 4.5.2 MARKIERUNG UND IDENTIFIZIERUNG ............................................................................... 89 4.5.3 VERPAARUNG ............................................................................................................. 89 4.5.4 ETABLIERUNG VON MAUSLINIEN .................................................................................... 90 4.5.5 GENERIERUNG VON LI-MAEUSEN AUS L2-MAEUSEN ....................................................... 90 4.5.6 GENOTYPISIERUNG DER SLACK-MUTANTEN .................................................................... 92 4.5.7 GENOTYPISIERUNG DER NACHKOMMEN DER CRE-DELETER-MAEUSE ................................. 93 5 ERGEBNISSE ........................................................................................................................ 94 5.1 KNOCKOUT-STRATEGIE .......................................................................................................... 94 5.1.1 ARCHITEKTUR DES KNOCKOUT-KONSTRUKTES .................................................................. 96 5.2 KLONIERUNG DES KNOCKOUT-VEKTORS .................................................................................. 99 5.2.1 HILFSVEKTOREN .......................................................................................................... 100 5.2.2 ISOLIERUNG UND SUBKLONIEREN DER HOMOLOGIEBEREICHE AUS DEM BAC ................. 101 5.2.3 GENERIERUNG DES PCR-FRAGMENTES ...................................................................... 103 5.2.4 SUBKLONIERUNG DES KURZEN ARMS ........................................................................... 104 5.2.5 SUBKLONIERUNG DES LANGEN ARMS ........................................................................... 106 5.2.6 ZUSAMMENSETZEN DES KNOCKOUT-VEKTORS ............................................................. 110 5.3 GEZIELTE INAKTIVIERUNG VON SLO2.2 IN EMBRYONALEN STAMMZELLEN DER MAUS ................ 111 5.3.1 1. TARGETING ............................................................................................................ 112 5.3.2 NACHWEIS DER HOMOLOGEN REKOMBINATION (1. TARGETING) .................................... 113 5.3.3 ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE DES 1. TARGETINGS ........................................ 121 5.3.4 2. TARGETING ............................................................................................................ 122 5.3.5 NACHWEIS DER CRE-REKOMBINATION (2. TARGETING) ................................................ 123 5.3.6 ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE DES 2. TARGETINGS ........................................ 128 5.4 GENERIERUNG VON CHIMAEREN, KEIMBAHNGAENGIGKEIT UND F1 .......................................... 131 5.4.1 BLASTOZYSTENINJEKTIONEN ZUR GENERIERUNG VON CHIMAEREN .................................... 131 5.4.2 CHIMAERISMUS .......................................................................................................... 134 5.4.3 KEIMBAHNGAENGIGKEIT ............................................................................................. 137 5.4.4 IDENTIFIZIERUNG VON HETEROZYGOTEN MAEUSEN ZUR ETABLIERUNG VON SLACK-L1 UND L2 MAUSLINIEN ............................................................................................................. 138 5.5 GENERIERUNG VON SLACK-L1 -MAEUSEN .............................................................................. 139 6 DISKUSSION UND AUSBLICK ........................................................................................... 140 6.1 CHIMAEREN UND KEIMBAHNGAENGIGKEIT ............................................................................. 140 6.2 MOEGLICHE KOMPENSATIONSMECHANISMEN ....................................................................... 144 6.3 INFORMATIONSGEWINN DURCH DIE SLACK-KNOCKOUT-MAUS .................................................. 145 6.3.1 UNTERSCHEIDUNG ZWISCHEN SLACK UND SLICK ........................................................... 145 6.3.2 PHAENOTYPISIERUNG DER MAEUSE ................................................................................ 146 6.4 STACK-KANAELE ALS POTENTIELLE ARZNEISTOFFTARGETS ........................................................... 150 7 ZUSAMMENFASSUNG ........................................................................................................ 152 8 LITERATURVERZEICHNIS .................................................................................................. 154 9 DANKSAGUNG 167
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