Regulation von antimikrobiellen Peptiden in pulmonalen Infektionen:
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Berlin
Mensch & Buch
2010
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INHALTVERZEICHNIS
INHALTVERZEICHNIS 2
ABBILDUNGSVERZEICHNIS 6
TABELLENVERZEICHNIS 7
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 8
1 EINLEITUNG 10
1.1 PNEUMONIE 10
1.1.1 LEGIONELLENPNEUMONIE 11
1.1.2 PNEUMOKOKKENPNEUMONIE 12
1.2 PATHOGENE 12
1.2.1 LEGIONELLA PNEUMOPHILA 12
1.2.1.1 LEBENSZYKLUS 13
1.2.1.2 VIRULENZFAKTOREN 14
1.2.2 STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE 15
1.2.2.1 VIRULENZFAKTOREN 16
1.3 IMMUNSYSTEM 17
1.3.1 ANGEBORENES IMMUNSYSTEM 17
1.3.2 MUSTERERKENNENDE REZEPTOREN (*PATTERN RECOGNITION RECEPTORS ,
PRRS) 18 1.3.2.1 TOLL-LIKE REZEPTOREN (TLR) 19
1.3.2.2 NUKLEOTID-BINDING OLIGOMERISATIONS-DOMAENE (NOD)-IIKE REZEPTOREN
(NLRS) 20 1.4 SIGNALTRANSDUKTION 21
1.4.1 MITOGEN-AKTIVIERTE PROTEINKINASEN (MAPK) 22
1.4.2 PHOSPHOINOSITID-3-KINASEN (PI3K) 22
1.4.3 PROTEINKINASEN C (PKC) 23
1.4.4 NUCLEAR TRANSCRIPTION FACTOR-KB ( N F - K B) 23
1.4.5 TRANSCRIPTION FACTOR ACTIVATOR PROTEIN 1 (AP-1) 24
1.4.6 INTERFERON-REGULATORY FACTOR (IRF) 24
1.5 ZYTOKINE 24
1.6 ANTIMIKROBIELLE PEPTIDE (AMP) 25
1.6.1 AMP DES MENSCHEN 26
1.6.1.1 CATHELIZIDINE 26
1.6.1.2 DEFENSINE 27
1.6.2 DIE BEDEUTUNG VON AMP IN DER PATHOGENESE VON KRANKHEITEN 28
1.6.3 REGULATION VON AMP 30
1.6.3.1 REGULATION VON CATHELIZIDIN 30
DIE BEDEUTUNG VON 1,25(OH) 2D3 (VITAMIN D3) IN DER
CATHELIZIDINEXPRESSION 30 DIE REGULATION BEI INFEKTIONEN 31
1.6.3.2 REGULATION VON SS-DEFENSINEN 32
HUMANES SS-DEFENSIN 2 (HBD2) 32
HUMANES SS-DEFENSIN 3 (HBD3) 33
1.6.4 RESISTENZMECHANISMEN GEGEN AMP 33
1.7 ZIELSETZUNG 34
2 MATERIAL UND METHODEN 35
2.1 MATERIAL 35
2.1.1 VERWENDETE ZELLEN 35
2.1.1.1 ALVEOLAR TYP II EPITHELZELLLINIE (A549) 35
2.1.1.2 SMALL AIRWAY EPITHELIAL CELLS (SAEC) 35
2.1.1.3 HUMANE BRONCHIAL-EPITHELZELLLINIE (BEAS-2B) 35
2.1.1.4 PRIMAERE HUMANE ALVEOLAERE MAKROPHAGEN 35
2.1.1.5 PRIMAERE HUMANE KERATINOZYTEN 36
2.1.1.6 KOLOREKTALE EPITHELZELLEN (CACO-2) 36
2.1.2 HUMANE LUNGENGEWEBSPROBEN 36
2.1.3 ZELLKULTURFLASCHEN UND ZELLKULTURSCHALEN 36
2.1.4 KULTURMEDIEN, KRYOMEDIEN UND ADHAESIONSFLUESSIGKEITEN 36
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN HTTP://D-NB.INFO/1009946943
DIGITALISIERT DURCH
IMAGE 2
VERZEICHNISSE
2.1.5 BAKTERIEN 37
2.1.5.1 STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE STAEMME D39, R6X UND R6XAPLY 37
2.1.5.2 LEGIONELLA PNEUMOPHILA STAEMME 130B, JR32, JR32 ADOTA, CORBY,
CORBY AFLAA UND CORBY ALSPDE 38
2.1.5.3 STAPHYLOCOCCUSAUREUSW 38
2.1.6 BAKTERIENKULTUR 38
2.1.6.1 SONSTIGE MATERIALIEN FUER DAS ARBEITEN MIT BAKTERIEN 38
2.1.7 STIMULANZIEN, ENZYME UND CHEMISCHE INHIBITOREN 39
2.1.8 PUFFER, LOESUNGEN UND GELE 39
2.1.9 PRIMER, SMALL INTERFERING RNAS (SIRNAS) UND PLASMIDE 41
2.1.9.1 PRIMAERE UND SEKUNDAERE ANTIKOERPER WESTERN BLOT, CHIP UND
KONFOKALMIKROSKOPIE 42 2.1.10 GERAETE 43
2.1.11 VERBRAUCHSMATERIALIEN 44
2.2 METHODEN 44
2.2.1 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 44
2.2.1.1 KULTIVIERUNG UND SUBKULTIVIERUNG DER A549 ZELLEN 44
2.2.1.2 KULTIVIERUNG DER SAE ZELLEN 45
2.2.1.3 KULTIVIERUNG UND SUBKULTIVIERUNG DER BEAS-2B ZELLEN 45
2.2.1.4 KULTIVIERUNG DER PRIMAEREN HUMANEN ALVEOLARMAKROPHAGEN 45
2.2.1.5 KULTIVIERUNG DER PRIMAEREN KERATINOZYTEN 46
2.2.1.6 KULTIVIERUNG DER CACO-2 ZELLEN 46
2.2.1.7 BESTIMMUNG DER ZELLZAHLEN 46
2.2.1.8 KRYOKONSERVIERUNG 46
2.2.1.9 AUFTAUEN VON ZELLEN 47
2.2.2 MIKROBIOLOGISCHE METHODEN 47
2.2.2.1 STERILISATION 47
2.2.2.2 BAKTERIENKULTUR 47
LAGERUNG UND ANZUCHT VON L PNEUMOPHILA 47
STIMULATION DER ZELLEN MIT L. PNEUMOPHILA 47
REPLIKATIONSVERSUCHE MIT L. PNEUMOPHILA 48
LAGERUNG UND ANZUCHT VON S. PNEUMONIAE 48
STIMULATION DER ZELLEN MIT S. PNEUMONIAE 49
REPLIKATIONSVERSUCHE MIT S. PNEUMONIAE 49
2.2.2.3 EINSATZ VON INHIBITOREN 49
2.2.2.4 AUFREINIGUNG BAKTERIELLER NUKLEINSAEUREN 49
2.2.2.5 ZYTOPLASMATISCHE LYSATE VON L. PNEUMOPHILA 49
2.2.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 50
2.2.3.1 EXTRAKTION UND KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON GESAMT-RNA 50
2.2.3.2 SEMIQUANTITATIVE RT-PCR 50
CDNA SYNTHESE 50
POLYMERASE-KETTENREAKTION UND DNA-GELELEKTROPHORESE 50
2.2.3.3 TRANSIENTE TRANSFEKTION VON »SMALL INTERFERING RNA (SIRNA) 51
A549 ZELLEN 51
BEAS-2B-ZELLEN 51
2.2.4 BIOCHEMISCHE METHODEN 52
2.2.4.1 ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) 52
2.2.4.2 ISOLIERUNG VON GESAMT- UND FRAKTIONIERTEN PROTEINEXTRAKTEN 52
GESAMTPROTEINEXTRAKTION 52
FRAKTIONIERTE EXTRAKTION VON ZYTOSOLISCHEN UND KERNPROTEINEN 52
2.2.4.3 PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD 52
2.2.4.4 SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE 53
2.2.4.5 WESTERN BLOT 53
2.2.4.6 CHROMATIN IMMUNPRAEZIPITATION (CHIP) 53
2.2.4.7 KONFOKALMIKROSKOPIE 54
2.2.5 STATISTIK 54
3 ERGEBNISSE 56
3.1 REGULATION VON CATHELIZIDIN IN DER INFEKTION MIT L. PNEUMOPHILA 56
3.1.1 CATHELIZIDIN ZEIGT ANTIMIKROBIELLE AKTIVITAET GEGEN L PNEUMOPHILA
56
IMAGE 3
VERZEICHNISSE
3.1.2 L. PNEUMOPHILA INDUZIERT DIE INHIBIERUNG DER CATHELIZIDINBILDUNG
IN HUMANEN ALVEOLAEREN EPITHELZELLEN UND HUMANEN ALVEOLAEREN MAKROPHAGEN
57 3.1.3 L. PNEUMOPHILA- INDUZIERTE INHIBIERUNG DER
CATHELIZIDINEXPRESSION IST ABHAENGIG VON BAKTERIELLEN NUKLEINSAEUREN 59
3.1.4 NUKLEINSAEUREN VERSCHIEDENER PULMONALER ERREGER INHIBIEREN DIE
SEKRETION VON CATHELIZIDIN 60
3.1.5 ERKENNUNG VON L. PNEUMOPHILA DURCH TLR9 UND TLR3 REGULIERT DAS
INTRAZELLULAERE WACHSTUM VON L. PNEUMOPHILA IN HUMANEN EPITHELZELLEN 61
3.1.6 L. PNEUMOPHILA INDUZIERT DIE VERMINDERTE EXPRESSION VON RXRA 62
3.1.7 RXRA IST ESSENZIELL FUER DIE CATHELIZIDINBILDUNG 63
3.1.8 AKTIVIERUNG VON IRF3 UND IRF7 VERMITTELT REDUZIERTE LL-37
EXPRESSION 63 3.1.9 IRF3 UND IRF7 REGULIEREN DIE EXPRESSION VON HES1 64
3.1.10 HES1 INHIBIERT DIE TRANSKRIPTION VON RXRA GEFOLGT VON
VERMINDERTER LL-37 PROMOTORAKTIVITAET 65
3.1.11 ODN UND POLI I:C REDUZIEREN RXRA UND CATHELIZIDIN IM HUMANEN
LUNGENGEWEBE, PRIMAEREN KERATINOZYTEN UND INTESTINALEN EPITHELZELLEN 66
3.1.12 VITAMIN D 3 INHIBIERT DIE L PNEUMOPMA-INDUZIERTE
CATHELIZIDINREDUKTION UND REGULIERT DIE INTRAZELLULAERE REPLIKATION VON
L. PNEUMOPHILA IN HUMANEN
LUNGENEPITHELZELLEN 67
3.2 EXPRESSION VON HBD2 UND HBD3 IN DER INFEKTION MIT L PNEUMOPHILA 69
3.2.1 HBD2 UND HBD3 ZEIGEN ANTIMIKROBIELLE AKTIVITAET GEGENUEBER L.
PNEUMOPHILA 69 3.2.2 L PNEUMOPHILA INDUZIERT HBD2 UND HBD3 SEKRETION IN
HUMANEN LUNGENEPITHELZELLEN 71
3.2.3 L PNEUMOPHILA INDUZIERT HBD2 UND HBD3 UNABHAENGIG VOM TYP II- UND
TYP IVB- SEKRETIONSSYSTEM 72
3.2.4 FLAGELLIN-ABHAENGIGE INDUKTION VON HBD2 UND HBD3 73
3.2.5 HBD2 UND HBD3 SEKRETION WIRD UEBER TLR-AKTIVIERUNG IN HUMANEN
LUNGENEPITHELZELLEN INDUZIERT 74
3.2.6 L. PNEUMOPHILA- INDUZIERTE HBD2 SEKRETION WIRD IN HUMANEN
LUNGENEPITHELZELLEN DURCH TLR2 UND TLR5 VERMITTELT 74
3.2.7 HBD3 SEKRETION WIRD DURCH TLR2, TLR5 UND TLR9 VERMITTELT 75
3.2.8 JNK UND P38 MAPK VERMITTELN L. PNEUMOPM/A-INDUZIERTE HBD2 UND HBD3
SEKRETION 76
3.2.9 ROLLE VON PI3K UND PKC IN DER L. PNEUMOPHILA- INDUZIERTE HBD2 UND
HBD3 SEKRETION 77
3.2.10 ROLLE VON NF-KB UND AP-1 IN DER L PNEUMOPHILA- INDUZIERTE HBD2
UND HBD3 SEKRETION 78
3.3 EXPRESSION VON LL-37, HBD2 UND HBD3 DURCH S. PNEUMONIAE IN DER
HUMANEN LUNGE 80
3.3.1 HBD2 UND HBD3 IN DER INFEKTION MIT S. PNEUMONIAE IN VITRO 81
3.3.1.1 HBD2 UND HBD3 ZEIGEN ANTIMIKROBIELLE AKTIVITAET GEGENUEBER S.
PNEUMONIAE 81 3.3.1.2 S. PNEUMONIAE INDUZIERT HBD2 UND HBD3 EXPRESSION
IN HUMANEN BRONCHIAL-EPITHELZELLEN 82 3.3.1.3 S. PNEUMCRAAEE-INDUZIERTE
HBD2 UND HBD3 PRODUKTION IST TLR2 ABHAENGIG 84 3.3.1.4 JNK VERMITTELT DIE
S. PNEUMONIAE- INDUZIERTE HBD3 PRODUKTION 84
3.3.1.5 PI3K VERMITTELT DIE S. PNEUMON/AE-INDUZIERTE HBD2 PRODUKTION 85
3.3.1.6 NF-KB REGULIERT S. PNEUMON/AE-INDUZIERTE HBD2 SEKRETION UND AP-1
IST IN DER S. PNEUMONIAE-INDUZIERTE HBD3 SEKRETION INVOLVIERT 87
4 DISKUSSION 89
4.1 REGULATION VON CATHELIZIDIN DURCH L. PNEUMOPHILA 89
4.1.1 L. PNEUMOPHILA IST SENSITIV GEGENUEBER LL-37 89
4.1.2 REDUKTION DER LL-37 EXPRESSION DURCH BAKTERIELLE NUKLEINSAEUREN 90
4.1.3 DIE ROLLE VON TL3 UND TLR9 92
4.1.4 AKTIVIERUNG VON IRF3 UND IRF7 VERMITTELT REDUZIERTE LL-37
EXPRESSION 93 4.1.5 IRF-INDUZIERTE HES1 EXPRESSION INHIBIERT DIE
TRANSKRIPTION VON RXRA MIT RESULTIEREND VERMINDERTER LL-37
PROMOTORAKTIVITAET 94
IMAGE 4
VERZEICHNISSE
4.1.6 HUMANE LUNGE IM EX VIVO MODELL UND EPITHELZELLEN AUS HAUT UND DARM
95 4.1.7 WIRKUNG VON VITAMIN D 3 96
4.2 DIFFERENZIELLE REGULATION VON HBD2 UND HBD3 DURCH S. PNEUMONIAE UND
L. PNEUMOPHILA 97
4.2.1 REGULATION DER L PNEUMOP/W/A-INDUZIERTEN HBD2 UND HBD3 SEKRETION
97 4.2.1.1 L. PNEUMOPHILA IST SENSITIV GEGENUEBER HBD2 UND HBD3 97
4.2.1.2 L. PNEUMOPHILA -INDUZIERTE HBD2 UND HBD3 SEKRETION 99
DIE FUNKTION VON TLRS IN DER L PNEUMOPMA-INDUZIERTEN HBD2 UND HBD3
SEKRETION 99 DIE FUNKTION VON KINASEN IN DER L PNEUMOPMA-INDUZIERTEN
HBD2 UND HBD3 SEKRETION 100 DIE FUNKTION VON N F - KB UND AP-1 IN DER L
PNEUMOPMA-INDUZIERTEN HBD2 BZW. HBD3 SEKRETION 101 4.2.2 REGULATION DER
S. PNEUMON/AEE-INDUZIERTEN AMP EXPRESSION 102
4.2.2.1 S. PNEUMONIAE -INDUZIERTE AMP SEKRETION IM HUMANEN LUNGENMODELL
103 4.2.2.2 S. PNEUMONIAE IST SENSITIV GEGENUEBER HBD2 UND HBD3 103
4.2.2.3 S. PNEUMON/AE-INDUZIERTE HBD2 UND HBD3 SEKRETION IN VITRO 103
DIE FUNKTION VON TLR2 IN DER S. PNEUMON/AE-INDUZIERTEN HBD2 UND HBD3
SEKRETION 104 DIE FUNKTION VON KINASEN IN DER S. PNEUMON/AEE-INDUZIERTEN
HBD2 UND HBD3 SEKRETION 105 DIE FUNKTION VON N F - KB UND AP-1 IN DER S.
PNEUMON/AE-INDUZIERTEN HBD2 UND HBD3 SEKRETION 106 4.3 REGULATION VON
AMP DURCH PULMONALE ERREGER: EIN VERGLEICH 107
4.4 AUSBLICK 108
4.4.1 DIE ROLLE VON BAKTERIELLEN NUKLEINSAEUREN ALS VIRULENZFAKTOREN IN
DER REGULATION VON LL-37 108
4.4.2 DIE FUNKTION VON PRRS IN DER REGULATION VON LL-37 109
4.4.3 ANTIMIKROBIELLE PEPTIDE IM THERAPIEVERFAHREN 109
4.4.4 DIAGNOSTIK 110
REFERENZEN 112
ANHANG 123
PUBLIKATIONEN UND KONGRESSBEITRAEGE 123
ORIGINALARBEITEN 123
KONGRESSBEITRAEGE 123
DANKSAGUNGEN 124
TABELLARISCHER LEBENSLAUF 125
SELBSTSTAENDIGKEITSERKLAERUNG 126
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