Verfügbarkeit: Funktion und Expression der transmembranen Isoformen des HLA-Klasse-III-Gens LST1

Funktion und Expression der transmembranen Isoformen des HLA-Klasse-III-Gens LST1:

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser:	Schiller, Christian 1978- (VerfasserIn)
Format:	Abschlussarbeit Buch
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Veröffentlicht:	2009
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adam_text	1 ZUSAMMENFASSUNG ....................................................................................................................... 6 2 EINLEITUNG ....................................................................................................................................... 7 2.1 DER HLA-KOMPLEX ................................................................................................................... 7 2.2 DIE HLA-KLASSE-ILL-REGION ..................................................................................................... 8 2.3 DAS LST1-GEN ........................................................................................................................ 8 2.3.1 GENOMISCHE LOKALISATION VON LST1 ................................................................................ 9 2.3.2 EXON-INTRON-STUKTUR VON LST1 ........................................................................................ 9 2.3.3 TRANSKRIPTION VON LST1 .................................................................................................. 10 2.3.4 TRANSLATION VON LST1 ..................................................................................................... 12 2.3.5 LST1-POLYMORPHISMEN .................................................................................................. 14 2.3.6 FUNKTION VON LST1 .......................................................................................................... 18 3 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT ........................................................................................................... 20 4 MATERIAL ........................................................................................................................................ 21 4.1 ARBEITEN MIT BAKTERIEN .......................................................................................................... 21 4.1.1 BAKTERIENSTAEMME ........................................................................................................... 21 4.1.2 KULTURMEDIEN FUER BAKTERIEN ........................................................................................... 21 4.1.3 SELEKTIONSANTIBIOTIKA FUER BAKTERIEN ................................................................................ 21 4.2 ARBEITEN MIT EUKARYOTISCHEN ZELLEN ...................................................................................... 21 4.2.1 EUKARYOTISCHE ZELLLINIEN ................................................................................................. 21 4.2.2 KULTURMEDIEN FUER EUKARYOTISCHE ZELLEN ......................................................................... 22 4.3 ENZYME .................................................................................................................................. 22 4.3.1 RESTRIKTIONSENZYME ....................................................................................................... 22 4.3.2 SONSTIGE ENZYME ........................................................................................................... 23 4.4 NUKLEINSAEUREN ....................................................................................................................... 23 4.4.1 VEKTOREN ......................................................................................................................... 23 4.4.2 OLIGONUKLEOTIDE .............................................................................................................. 24 4.4.3 GROESSENSTANDARDS ........................................................................................................... 25 4.5 ANTIKOERPER .............................................................................................................................. 25 4.6 KITS UND SPEZIELLE REAGENZIEN ............................................................................................ 26 4.7 GEBRAUCHSLOESUNGEN ......................................................................................... 26 4.8 VERBRAUCHSMATERIALIEN ......................................................................................................... 27 4.9 GERAETE .................................................................................................................................... 28 5 METHODEN .................................................................................................................................... 30 5.1 ARBEITEN MIT BAKTERIEN .......................................................................................................... 30 5.1.1 GIESSEN VON AGARPLATTEN ................................................................................................. 30 5.1.2 ANZUCHT VON BAKTERIEN IM SCHUETTELINKUBATOR ................................................................ 30 5.1.3 EINFRIEREN VON BAKTERIEN ................................................................................................ 30 5.1.4 TRANSFORMATION DURCH HITZESCHOCK ................................................................................ 30 5.2 ARBEITEN MIT EUKARYOTISCHEN ZELLEN ...................................................................................... 31 5.2.1 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL .............................................................................................. 31 5.2.2 KULTIVIEREN VON EUKARYOTISCHEN ZELLEN .......................................................................... 31 5.2.3 KRYOKONSERVIERUNG VON ZELLEN ...................................................................................... 32 5.2.4 TRANSFEKTION MITTELS LIPOFEKTION ..................................................................................... 32 5.2.5 TRANSFEKTION MITTELS ELEKTROPORATION ............................................................................. 33 5.2.6 DURCHFLUSSZYTOMETRIE ..................................................................................................... 33 5.2.7 POLYLYSIN-BESCHICHTUNG VON DECKGLAESCHEN .................................................................. 34 5.2.8 IMMUNZYTOCHEMIE ......................................................................................................... 34 5.2.9 MIKROSKOPIE VON LEBENDEN ZELLEN .................................................................................. 35 5.2.10 ZELLMARKIERUNG DURCH FLUORESZENZFARBSTOFFE ............................................................. 35 5.2.11 ISOLIERUNG VON EXOSOMEN ............................................................................................ 35 5.2.12 IMMUNISIERUNG UND ETABLIERUNG VON HYBRIDOMZELLLINIEN ............................................ 36 5.2.13 GENERIERUNG VON UNREIFEN UND REIFEN DC ................................................................... 36 5.3 ARBEITEN MIT NUKLEINSAEUREN .................................................................................................. 37 5.3.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNS AUS BAKTERIEN ................................................................. 37 5.3.2 ISOLIERUNG VON RNS AUS EUKARYOTISCHEN ZELLEN ............................................................ 38 5.3.3 REINIGEN VON DNS DURCH PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION ............................................. 38 5.3.4 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN .......................................................... 39 5.3.5 POLYMERASE-KETTENREAKTION ........................................................................................... 39 5.3.6 RT-PCR .......................................................................................................................... 43 5.3.7 AGAROSEGELELEKTROPHORESE ............................................................................................ 43 5.3.8 PRAEPARATIVE AGAROSEGELELEKTROPHORESE ........................................................................ 44 5.3.9 KLONIERUNG VON PCR-PRODUKTEN .................................................................................... 44 5.3.10 RESTRIKTIONSVERDAU ....................................................................................................... 44 5.3.11 LIGATION ......................................................................................................................... 44 5.3.12 SEQUENZIEREN VON PLASMIDEN ..................................................................................... 44 5.4 ARBEITEN MIT PROTEINEN .......................................................................................................... 44 5.4.1 HERSTELLUNG VON LYSATEN AUS EUKARYOTISCHEN ZELLEN ................................................... 44 5.4.2 HERSTELLUNG VON PROTEINEXTRAKTEN AUS BAKTERIEN ......................................................... 45 5.4.3 PROTEINREINIGUNG MITTELS AFFINITAETSSAEULENCHROMATOGRAPHIE ..........................................45 5.4.4 DIALYSE VON PROTEINLOESUNGEN ........................................................................................ 46 5.4.5 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION MITTELS DER BRADFORD-METHODE ....................... 46 5.4.6 SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE .......................................................................... 46 5.4.7 ANFAERBEN VON PROTEINEN MITTELS COOMASSIEFAERBUNG .................................................... 47 5.4.8 ANFAERBEN VON PROTEINEN MITTELS SILBERFAERBUNG ............................................................. 47 5.4.9 WESTERN-ANALYSE ........................................................................................................... 48 5.4.10 IMMUNDETEKTION VON WESTERN-MEMBRANEN ................................................................ 48 5.4.11 QUANTITATIVE IMMUNDETEKTION VON WESTERN-MEMBRANEN .......................................... 49 5.4.12 STRIPPEN VON WESTERN-MEMBRANEN ............................................................................ 50 5.4.13 IMMUNPRAEZIPITATION ...................................................................................................... 50 5.4.14 PRAEABSORPTION VON HYBRIDOMUEBERSTAENDEN .................................................................. 51 6 ERGEBNISSE ................................................................................................................................. 52 6.1 HERSTELLUNG VON LST1 -EXPRESSIONSVEKTOREN ....................................................................... 52 6.1.1 ISOLIERUNG VON LST1-SPLEISSVARIANTEN ........................................................................... 52 6.1.2 CHARAKTERISIERUNG EINER NEUEN LST1-SPLEISSVARIANTE ................................................... 55 6.1.3 KLONIERUNG VON LST1 -EXPRESSIONSVEKTOREN ................................................................. 57 6.2 HERSTELLUNG VON MONOKLONALEN LST1-ANTIKOERPERN .............................................................. 62 6.2.1 ISOLIERUNG VON REKOMBINANTEM HIS-LST1 .................................................................... 62 6.2.2 IMMUNISIERUNG UND ETABLIERUNG VON HYBRIDOMZELLLINIEN ............................................. 64 6.2.3 CHARAKTERISIERUNG DER MONOKLONALEN LST1-ANTIKOERPER ................................................ 64 6.3 PROTEINCHARAKTERISIERUNG VON LST1 ..................................................................................... 72 6.3.1 LST1 KODIERT EVOLUTIONAER KONSERVIERTE PROTEINE ........................................................... 72 6.3.2 LST1 KODIERT TYP-I-TRANSMEMBRANPROTEINE ................................................................. 74 6.3.3 LST1 -TRANSMEMBRANISOFORMEN BILDEN MULTIMERE MITTELS DISULFIDBRUECKEN ................ 77 6.3.4 TYROSIN-PHOSPHORYLIERUNG VON LST1 ............................................................................ 79 6.3.5 LST1 DIMERISIERT NACH KREUZVEMETZUNG ...................................................................... 83 6.3.6 FUNKTIONELLE BEREICHE DER LST1 -TRANSMEMBRANISOFORMEN ........................................ 84 6.4 CHARAKTERISIERUNG DER ZELLMORPHOLOGIE-MODULATION DURCH LST1 ....................................... 86 6.4.1 LST1 -UEBEREXPRESSION INDUZIERT MORPHOLOGISCHE VERAENDERUNGEN .............................. 86 6.4.2 LST1 INDUZIERT DIE BILDUNG VON TNT ............................................................................. 87 6.4.3 LST1 INDUZIERT DIE BILDUNG VON FUNKTIONELLEN TNT ....................................................... 91 6.4.4 NACHWEIS VON ENDOGENEM LST1 IN TNT ...................................................................... 95 6.5 CHARAKTERISIERUNG DER LST1-PROTEINEXPRESSION .................................................................. 97 6.5.1 REGULATION DER LST1-PROTEINEXPRESSION ...................................................................... 97 6.5.2 LST1-PROTEINEXPRESSION IN DC ................................................................................... 101 7 DISKUSSION ................................................................................................................................. 104 7.1 CHARAKTERISIERUNG UND FUNKTIONSANALYSE VON LST1 ......................................................... 104 7.1.1 EVOLUTION DES LST1-GENS ............................................................................................ 104 7.1.2 PROTEINCHARAKTERISIERUNG VON LST1 UND FUNKTION ALS POTENTIELLES TRAP ................ 105 7.1.3 MODULATION DER ZELLMORPHOLOGIE DURCH LST1 .............................................................. 111 7.2 EXPRESSION VON LST1 ......................................................................................................... 116 7.2.1 REGULATION DER LST1-EXPRESSION ................................................................................ 116 7.2.2 REGULATION DER LST1-EXPRESSION IN DC ..................................................................... 117 7.3 ARBEITSMODELL ...................................................................................................................... 119 8 LITERATURVERZEICHNIS ................................................................................................................... 121 9 ANHANG ...................................................................................................................................... 129 9.1 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS ...................................................................................................... 129 9.2 LST7-SEQUENZ .................................................................................................................... 131 9.3 LSD-POLYMORPHISMEN ....................................................................................................... 133 9.4 CHARAKTERISIERUNG DER MONOKLONALEN LST1-ANTIKOERPER .................................................... 134 9.5 PROTEINVERGLEICHE ................................................................................................................ 136 9.6 VERWENDETE VEKTOREN ......................................................................................................... 137 10 DANKSAGUNG ........................................................................................................................... 140
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