Substrat-Translokation im 20S Proteasom aus Thermoplasma acidophilum:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
München
Verl. Dr. Hut
2011
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| Ausgabe: | 1. Aufl. |
| Schriftenreihe: | Biochemie
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| Beschreibung: | 145 S. Ill., graph. Darst. 210 mm x 148 mm, 231 g |
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS 2
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 5
ABBILDUNGS- UND TABELLENVERZEICHNIS 8
ZUSAMMENFASSUNG 12
SUMMARY 14
1. EINLEITUNG 15
1.1 DAS 20S PROTEASOM 16
1.1.1 STRUKTUR DES 20S PROTEASOMS 16
1.1.2 KATALYTISCHER MECHANISMUS DES 20S PROTEASOMS 18
1.2 DAS REGULATORISCHE PARTIKEL PAN 20
1.2.1 FUNKTION DES REGULATORISCHEN PARTIKELS PAN 20
1.2.2 STRUKTUR DES REGULATORISCHEN PARTIKELS PAN 20
1.3 TRANSLOKATION VON SUBSTRATEN 22
1.4 AUFGABENSTELLUNG 23
2. MATERIAL UND METHODEN 26
2.1. MATERIAL 26
2.1.1. CHEMIKALIEN UND VERBRAUCHSMATERIAL 26
2.1.2. GERAETE 26
2.1.3. KITS UND STANDARDS 26
2.1.4. ENZYME UND ANTIKOERPER 28
2.1.5. BAKTERIENSTAEMME UND MEDIEN 29
2.1.6. PUFFER UND LOESUNGEN 29
2.1.6.1. LOESUNGEN FUER MOLEKULARBIOLOGISCHE ARBEITSMETHODEN 30
2.1.6.2. LOESUNGEN FUER BIOCHEMISCHE ARBEITSMETHODEN 30
2.1.6.3. LOESUNGEN FUER IMMUNOLOGISCHE ARBEITSMETHODEN 33
2.1.7. PLASMIDE 33
2.1.8. PRIMER 33
2.2. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 34
2.2.1. HERSTELLUNG HITZEKOMPETENTER .CO//-ZELLEN 34
2.2.2. HITZESCHOCKTRANSFORMATION 34
2.2.3. ZIELGERICHTETE MUTAGENESE 35
2.2.4. ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E.COLI 37
2.2.5. RESTRIKTIONSVERDAU 37
2.2.6. AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 38
2.2.7. GELELUTION UND LIGATION 39
2.2.8. DNA-SEQUENZIERUNG 39
2.3. BIOCHEMISCHE ARBEITSMETHODEN 39
2.3.1. EXPRESSION VON STRUKTURGENEN 40
2.3.1.1. REKOMBINANTE EXPRESSION IN E.COLI MIT IPTG-INDUKTION 40
2.3.2. ZELLAUFSCHLUSS VON E.COLI 41
2.3.3. CHROMATOGRAPHIE 41
2.3.3.1. NI-AJFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 42
2.3.3.2. GELFILTRATIONSCHROMATOGRAPHIE 42
2.3.4. AUTOMATISIERTE REINIGUNG MITTELS AEKTA EXPLORER-KIT 42
2.3.6. POLYACRYLAMID-GELELEKTORPHORESE 44
2
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN HTTP://D-NB.INFO/1010075411
DIGITALISIERT DURCH
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
2.3.6.1. SDS-PAGE 44
2.3.6.2. NATIVE PAGE 45
2.3.7. COOMASSIE-FAERBUNG 46
2.3.8. KONZENTRATIONSBESTIMMUNG 46
2.3.8.1. PHOTOMETRISCHE KONZENTRATIONSBESTIMMUNG 46
2.3.8.2. KALORIMETRISCHE PROTEINKONZENTRATIONSBESTIMMUNG 48
2.3.9. KONZENTRATION UND UMPUFFERN VON PROTEINLOESUNGEN 48
2.3.10. INHIBITION DES 20S PROTEASOMS DURCH CLASTO-LACTACYSTIN SS-LACTON
49 2.3.11. MARKIERUNG VON PROTEINEN MIT FLUORESZENZFARBSTOFFEN 49
2.3.12. HERSTELLUNG VON HOST-GUEST-KOMPLEXEN 50
2.4. IMMUNOLOGISCHE ARBEITSMETHODEN 50
2.5. BESTIMMUNG DER ENZYMATISCHEN AKTIVITAET 51
2.5.1. BESTIMMUNG DER ENZYMATISCHEN AKTIVITAET MIT SUC-LLVY-AMC UND MCA-
RPPGFSAFK(DPN)-OH 51
2.5.2 BESTIMMUNG DER ENZYMATISCHEN AKTIVITAET MIT CASEIN 53
2.5. MIKROSKOPIE 54
2.5.1. KONFOKALE MIKROSKOPIE 54
2.5.2. TRANSELEKTRONENMIKROSKOPIE 55
2.6. CD SPEKTROSKOPIE 56
2.7. KRISTALLISATION FUER DIE ROENTGENSTRUKTURANALYSE 57
2.8. MASSENSPEKTROMETRIE 57
3. ERGEBNISSE 58
3.1. UEBERSICHT 58
3.2. ERGEBNISSE MOLEKULARBIOLOGISCHER ARBEITEN 61
3.2.1. MUTAGENESE-PCR 61
3.2.2. KLONIERUNG 61
3.3. PROTEINEXPRESSION UND REINIGUNG 61
3.3.1. EXPRESSION UND REINIGUNG VON 20S PROTEASOMMUTANTEN UND
HYBRIDPROTEINEN 61 3.3.2. EXPRESSION UND REINIGUNG VON A-SYNUCLEIN 63
3.4 SUBSTRATVERTEILUNG IM 20S PROTEASOM 63
3.4.1 FLUORESZENZUNTERSUCHUNGEN VON HOST-GUEST-KOMPLEXEN AUF
EINZELMOLEKUELEBENE 64
3.4.2 UNTERSUCHUNG VON HYBRIDPROTEINEN DES 20S PROTEASOMS UND
A-SYNUCLEIN 68 3.5 EINFLUSS DER KONTAKTFLAECHEN ZWISCHEN DEN
UNTEREINHEITEN AUF DIE SUBSTRATTRANSLOKATION 73
3.5.1 KINETISCHE ANALYSEN DES WT 20S PROTEASOMS MIT VERSCHIEDENEN
SUBSTRATEN ...76 3.5.2 KINETISCHE ANALYSE VON 20S PROTEASOM-MUTATIONEN
AN DEN KONTAKTFLAECHEN..83 3.5.3 KRISTALLISATION VON 20S
PROTEASOMMUTANTEN UND HOST-GUEST-KOMPLEXEN 93 3.6. VERSTEIFUNG DER 20S
PROTEASOMSTMKTUR 95
4. DISKUSSION UND AUSBLICK 103
4.1 SUBSTRATVERTEILUNG IM 20S PROTEASOM 104
4.1.1 FLUORESZENZUNTERSUCHUNGEN VON HOST-GUEST-KOMPLEXEN AUF
EINZELMOLEKUELEBENE 104
4.1.2 UNTERSUCHUNGEN VON HYBRIDPROTEINEN DES 20S PROTEASOMS UND
U-SYNUCLEINLO5 4.2 EINFLUSS DER KONTAKTFLAECHEN ZWISCHEN DEN
UNTEREINHEITEN AUF DIE SUBSTRATTRANSLOKATION 106
4.3 VERSTEIFUNG DER 20S PROTEASOMSTRUKTUR 110
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
5. ANHANG 112
5.1. CHEMIKALIEN UND VERBRAUCHSMATERIAL 112
5.2. GERAETE 116
5.3. PLASMIDE 118
5.4. PRIMER 121
5.5. MASSENSPEKTROMETRISCHE ANALYSE DER SCHNITTSTELLEN IN BODIPY FL
CASEIN ZU VERSCHIEDENEN VERDAUZEITPUNKTEN 125
5.6. KINETISCHE ANALYSE VERSCHIEDENER MUTANTEN DES 20S PROTEASOMS 130
DANKSAGUNGEN 144
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