Die Bedeutung von GRAS-Proteinen für die Regulation der pflanzlichen Entwicklung in Arabidopsis thaliana:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2010
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
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BEDEUTUNG
VON
GRAS-PROTEINEN
FUER
DIE
REGULATION
DER
PFLANZLICHEN
ENTWICKLUNG
IN
ARABIDOPSIS
THALIANA
FAKULTAET
FUER
BIOLOGIE
UNIVERSITAET
BIELEFELD
I
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
8
1.1
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
8
1.1.1
DIE
TRANSKRIPTION
8
1.1.2
TRANSKRIPTIONSFAKTORENFAMILIEN
10
1.1.3
DIE
BEDEUTUNG
VON
REGULATORISCHEN
C;J-ELEMENTEN
FUER DIE
TRANSKRIPTIOA
12
1.2
DIE
GRAS-PROTEINE
12
1.3.
DIE
DELLA-UNTERGRUPPE
DER
GRAS-PROTEINE
15
1.3.1
GIBBERELLINE
15
1.3.2
DELLA-PROTEINE
UND
GIBBERELLINE
16
1.3.3
DIE
ROLLE
DER
DELLA-PROTEINE
FUER DIE
PFLANZLICHE
ENTWICKLUNG
18
1.4
DIE
PAT1-UNTERGRUPPE
DER
GRAS-PROTEINE
18
1.5
RNIRNA-VERMITTELTE
GENREGULATION
19
1.5.1
PRINZIP
DER MIRNA-VERMITTELTEN
GENREGULATION
19
1.5.2
VERBINDUNG
DER
GRAS-PROTEINE
MIT DER
MIRNA-VERMITTELTEN
GENREGULATION
21
1.6
ZIELSETZUNG
DER ARBEIT
21
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
24
2.1
IN
SILICO
ANALYSEN
24
2.1.1
GEN-UND
PROTEINANALYSEN
24
2.1.2
BEARBEITUNG
VON
SEQUENZFORMATEN
24
2.1.3
RESTRIKTIONSANALYSE
24
2.1.4
SEQUENZVERGLEICHE
24
2.1.5
VIRTUELLE
NORTHERNAUALYSEN
25
2.1.6
PROMOTORANALYSEN
25
2.1.7
ERMITTLUNG
VON
PROTEINCHARAKTERISTIKA
25
2.1.8
SUBZELLULAERE
PROTEINLOKALISIERUNG
25
2.2
PFLANZENMATERIAL
UND
ANZUCHTBEDINGUNGEN
25
2.2.1
PFLANZENMATERIAL
25
2.2.2
ANZUCHTBEDINGUNGEN
26
2.2.2.1
PFLANZENANZUCHT
AUF
ERDE
26
2.2.2.2
PFLANZENANZUCHT
IN
HYDROKULTUR
28
2.2.2.3
PFLANZENANZUCHT
AUF
MURASHIGE
&
SKOOG
MEDIUM
29
2.2.2.3.1
STERILISATION
VON
ARABIDOPSIS
THALIANA
SAMEN
29
2.2.2.3.2
MURASHIGE
&
SKOOG
MEDIEN
29
2.3
MOLEKULARGENETISCHE
ARBEITSMETHODEN
30
2.3.1
NUKLEINSAEUREANALYTIK
30
2.3.1.1
RNA-ISOLIENMG
30
INHALTSVERZEICHNIS
II
2.3.1.2
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
AUS
PFLANZENMATERIAL
31
2.3.1.2.1
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
OHNE
PHENOL/CHLOROFORRN-BEHANDLUNG
31
2.3.1.2.2
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
MIT
PHENOL/CHLOROFORM-BEHANDLUNG
32
2.3.1.3
QUANTIFIZIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
32
2.3.1.4
DNASE-BEHANDLUNG
UND
CDNA-SYNTHESE
33
2.3.1.5
PCR
34
2.3.1.6
RT-PCR
34
2.3.1.7
PRIMERDESIGN
36
2.3.1.8
PLASMIDE
36
2.3.1.8.1
ANZUCHT
VON
BAKTERIEN
36
2.3.1.8.2
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
37
2.3.1.8.3
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
38
2.3.1.8.4
ANLEGEN
VON
GLYCEROLKULTUREN
40
2.3.1.8.5
ISOLIERUNG
VON
PLASMIDEN
AUS
E.COH
40
2.3.1.8.5.1
PLASMID
MINI-PRAEPARATION
40
2.3.1.8.5.2
PLASMID
MAXI-PRAEPARATIONEN
41
2.3.1.9
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
42
2.3.1.10
RESTRIKTIONSANALYSE
42
2.3.1.11
AUFREINIGUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
42
2.3.1.12
GA/EWAY-ADAPTIERUNG
DER
VEKTOREN
35S
PEYFP
NOST
UND35S
PECFPNOST.
43
2.3.1.13
KLONIEREN
VON
ZIELSEQUENZEN
IN
DEN
PENTR/D-TOPO
VEKTOR
43
2.3.1.14
LR-REAKTION
43
2.3.1.15
DNA-SEQUENZIERUNG
43
2.3.1.16
CDNA-ARRAY
ANALYSEN
44
2.3.2
PROTEINANALYTIK
44
2.3.2.1
PROTEINISOLIERUNG
AUS
A.THALIANA
44
2.3.2.2
PROTEINISOLIERUNG
AUS
E.COLI
UNTER
DENATURIERENDEN
BEDINGUNGEN
44
2.3.2.3
PROTEINISOLIERUNG
AUS
E.COLI
UNTER
NATIVEN
BEDINGUNGEN
45
2.3.2.4
PROTEINQUANTIFIZIERUNG
NACH BRADFORD
46
2.3.2.5
PROTEINAUFREINIGUNG
46
2.3.2.5.1
AUFREINIGUNG
MITTELS
NI-NTA-AGAROSE
46
2.3.2.5.2
DIALYSE
DER
MITTELS
NI-NTA
AUFGEREINIGTEN
PROTEINE
46
2.3.2.5.3
AUFREINIGUNG
MITTELS
GST-AGAROSE
47
2.3.2.5.4
FRAKTIONIERTE
AMMONIUMSULFATFAELLUNG
47
2.3.2.6
POLYACRYLAMID-GELE
47
2.3.2.7
POLYACRYLAMID-GELBELADUNG
UND
GELLAUF.
48
2.3.2.8
IMMUNOBLOT
VON
PROTEINEN
(WESTERNBLOT)
48
2.3.2.8.1
ELEKTROTRANSFER
DER
PROTEINE
49
2.3.2.8.2
LADUNGSKONTROLLE
VIA
PONCEAU-S-FAERBUNG
50
III
INHALTSVERZEICHNIS
2.3.2.8.3
HYBRIDISIERUNG
DER
MEMBRAN
MIT
ANTIKOERPERN
50
2.3.2.8.4
DETEKTION
DES
WESTERNBLOTS
MITNBT/BCIP
ODER
LUMILIGHT
51
2.3.2.9
HERSTELLUNG
EINES
PEPTIDANTIKOERPERS
51
2.3.3
TRANSGENE
PFLANZEN
52
2.3.3.1
TRANSFORMATION
VON
A.THALIANA
MITTELS
FLORAL-DIP
52
2.3.3.2
SELEKTION
TRANSFORMIERTER
PFLANZEN
53
2.3.3.3
SELEKTION
VON
T-DNA-INSERTIONSLINIEN 53
2.3.3.4
ROOT-BENDING-ASSAY
(RBA)
53
2.3.3.5
ROTLICHT-EXPERIMENTE
53
2.3.3.6
BESTIMMUNG
VON
KEIMUNGSRATEN
54
2.3.3.7
ANALYSE
VON
KEIMLINGEN
54
2.4
MIKROSKOPISCHE
METHODEN 55
2.4.1
PROTOPLASTENISOLIERUNG
UND
TRANSFEKTION
55
2.4.2
LICHT-
UND
FLUORESZENZMIKROSKOPIE
57
2.4.3
INSILU
ANALYSEN
57
2.4.3.1
FAA-FIXIERUNG
UND
PARAPLASTEINBETTUNG
VON
PFLANZENGEWEBE
57
2.4.3.2
HERSTELLUNG
UND
FAERBUNG
VON
GEWEBESCHNITTEN
58
2.4.4
ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE
ANALYSEN
58
2.4.4.1
RASTERELEKTRONENMIKROSKOPIE
(REM)
58
2.4.4.2
TRANSELEKTRONENMIKROSKOPIE
(TEM)
59
2.4.5
ATOMIC-FORCE-MICROSCOPY
(AFM)
59
3.
ERGEBNISSE.
60
3.1
TRANSKRIPTANALYSEN
60
3.1.1
MUTANTENSELEKTION
60
3.1.2
IN
SILICO
ANALYSEN
62
3.1.2.1
VORAUSSAGEN
UEBER
TRANSKRIPTUENDERUNGEN
UNTER
ABIOTISCHEM
STRESS
62
3.1.2.2
VORAUSSAGEN
UEBER
TRANSKRIPTSPIEGEL
WAEHREND
DER
ENTWICKLUNG
70
3.1.2.3
VORAUSSAGEN
UEBER
TRANSKRIPTSPIEGEL
IN
DIVERSEN
MUTANTEN
72
3.1.2.4
ANALYSE
VON
CFE-ELEMENTEN
77
3.1.2.4.1
ANALYSE
DES
SCU-PROMOTORS
77
3.1.2.4.2
ANALYSE
DES
AEGI7-PROMOTORS
82
3.1.2.4.3
ANALYSE
DES
GL3-PROMOTORS
84
3.1.3
SEMIQUANTITATIVE
RT-PCRS
88
3.1.3.1
EXPRESSION
VON
ZIELGENEN
WAEHREND
DER
PFLANZLICHEN
ENTWICKLUNG
89
3.1.3.2
EXPRESSION
VON
ZIELGENEN
WAEHREND
ABIOTISCHEM
STRESS
92
3.1.3.3
EXPRESSION
VON
ZIELGENEN
UNTER
HORMONEINFLUSS
96
3.1.3.4
EXPRESSION
VON
ZIELGENEN
IN
MIRNA-MUTANTEN
100
3.1.4
ARRAY-ANALYSEN
103
INHALTSVERZEICHNIS
IV
3.2
PHAENOTYPISCHE
CHARAKTERISIERUNGEN
107
3.2.1
BESTIMMUNG
VON
KEIMUNGSRATEN
108
3.2.2
KEIMLINGSANALYSE
110
3.2.3
MIKROSKOPISCHE
ANALYSE
DER
GEWEBESTRUKTUR
116
3.2.4
RASTERELEKTRONENMIKROSKOPISCHE
ANALYSEN
125
3.2.5
VERGLEICH
VON
A.THALIANA
WILDTYP-
UND
MUTANTENPFLANZEN
129
3.2.5.1
VERGLEICH
VON
A.THALIANA WAEDTYP-
UND
MUTANTENPFLANZEN
IN
HYDROKULTUR
130
3.2.5.2
VERGLEICH
VON
A.THALIANA
WILDTYP-
UND
MUTANTENPFLANZEN
AUFMS-MEDIUM
138
3.2.6
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
BETEILIGUNG
AN
DER
PHOTOMORPHOGENESE
142
3.3
PROTEINANALYSEN
148
3.3.1
IN
SILICO
PROTEINANALYSEN
148
3.3.1.1
PHYLOGRAMME
DER
GRAS-PROTEINE
148
3.3.1.2
VORAUSSAGEN
ZU
DEN
PROTEINEIGENSCHAFTEN
VON
RGL1,
RGL3
UND
SCL5
150
3.3.1.3
VORAUSSAGEN
ZUR
PROTEINCYTOLOKALISIERUNG
VON
RGL1,
RGL3
UNDSCL5
151
3.3.2
IN
VIVO
PROTEINANALYSEN
151
3.3.2.1
LOKALISIERUNG
VON
RGL1
UND
RGL3
FUSIONSPROTEINEN
IN
A.THALIANA
PROTOPLASTEN
153
3.3.2.2
PROTEIN-PROTEIN
INTERAKTIONSANALYSEN
(FRET)
FIIRRGLL
UND
RGL3
FUSIONSPROTEINE
IN
A.THALIANA
PROTOPLASTEN
153
3.3.3
IN
VITRO
PROTEINANALYSEN
160
3.3.3.1
HETEROLOGE EXPRESSION
DER
A.THALIANA
PROTEINE
RGL1,
RGL3
UNDSCL5
ME.COLI
160
3.3.3.2
PROTEIN-DNA-INTERAKTIONSANALYSE
(EMSA)
162
3.3.3.3
PU// FT M7J-EXPERIMENTE
ZUR
BESTAETIGUNG
DER
IN
VIVO
FRET-ERGEBNISSE
165
3.3.3.4
ANALYSE
DES
SCL5-V5-HIS
PROTEINS
VIA
AFM
UND
TEM
168
3.3.3.5
SYNTHESE
EINES
SCL5-PEPTIDANTIKOERPERS
170
4.
DISKUSSION
174
4.1
GRAS-PROTEINE
ALS
INTEGRATOREN
FFLR
DIE
REGULATION
PFLANZLICHEN
WACHSTUMS
174
4.2
DIE
BEDEUTUNG
VON
RGL1,
RGL3
UND
SCL5
FUER
DIE
PFLANZLICHE
ENTWICKLUNG
177
4.2.1
ANALYSE
DER
TRANSKRIPTNIVEAUS
FUER
RGLI,
RGL3
UND
SCL5
WAEHREND
DER
PFLANZLICHEN
ENTWICKLUNG
177
4.2.2
ANALYSE
DER
RGSS-
UND
SCL5-
MUTANTENLINIEN
WAEHREND
DER
PFLANZLICHEN
ENTWICKLUNG
180
4.3.
ROLLE
VON
RGLI,
RGL3
UND
SCL5
WAEHREND
ABIOTISCHEM
STRESS
187
4.3.1
ANALYSE
DER
TRANSKRIPTNIVEAUS
FUER
RGLI,
RGL3
UND
SCL5
WAEHREND
ABIOTISCHEM
UND
HORMONELLEM
STRESS
187
V
INHALTSVERZEICHNIS
4.3.2
ANALYSE
DER
MUTANTENLINIEN
RGB
UND
SCL5
UNTER
ABIOTISCHEM
STRESS
191
4.4
BEDEUTUNG
VON
RGL3
UND
SCL5
FUER
DIE
PHOTOMORPHOGENESE
194
4.5
MORPHOLOGISCHE
ANALYSE
DER
SAMEN,
DES
EMBRYONALEN,
APIKALEN
SPROSSMERISTEMS
UND
DER
ERSTEN
ECHTEN
BLAETTER DER
MUTANTENLINIEN
RGL3
UND
SCL5
IM
VERGLEICH
ZUM
WILDTYP
195
4.6
VERKNUEPFUNG
VON
MIRNA-VERMITTELTER
GENREGULATION
MIT
DER
REGULATION
DER
RGL1-,
RGL3-
UND
SC5-EXPRESSION
197
4.6.1
VERWENDETE MUTANTEN
ZUR
ANALYSE
EINER
MOEGLICHEN
MIRNA-VERMITTELTENGRAS-REGULATION
200
4.6.2
UEBERPRUEFUNG
DER
TRANSKRIPTNIVEAUS
FUER
RGL1,
RGL3
UND
SCL5
IN
DEN
MIRNA-MUTANTEN
DCLI, HYLL
UND
SHEL
203
4.6.2.1
UEBERPRUEFUNG
DER
VERWENDETEN
MIRNA-MUTANTEN
AUF
EINE
HOMOZYGOTE
T-DNA-INSERTION 203
4.6.2.2
TRANSKRIPTANALYSEN
FUERRGLL,
RGL3
UND
SCL5
IN
DEN
MIRNA-MUTANTEN
DCLL,
HYLL
UND
SHEL
204
4.7
ANALYSE
DER
ENTWICKLUNGSSPEZIFISCHEN
ROLLE
FUER
SHE1
UND
HYL1
206
4.8
BEDEUTUNG
VON
HYL1
UND
SHE1
FUER
DIE
PHOTOMORPHOGENESE
209
4.9
BEDEUTUNG
DER
GENPRODUKTE
HYL1,
SHE1,
RGL3
UND
SCL5
FUER
DIE
PFLANZLICHE
MORPHOLOGIE
211
4.10
ANALYSE
DER
HOMO-
ODER
HETERODIMERISIERUNG
VON
RGL1,
RGL3
UNDSCLS
214
4.11
DNA-BINDUNG
VON
GRAS-PROTEINEN
216
4.12
3D-STRUKTURVERGLEICH
VON
RGL1
UND
RGL3
MIT
GAI
218
5.
ZUSAMMENFASSUNG
220
6.
LITERATUR.
222
7.
ANHANG
246
7.1
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
246
7.2
VEROEFFENTLICHUNGEN
256
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