Bedeutung der Beta-Arrestine und der G-Protein-gekoppelten Rezeptorkinasen für die Regulation des humanen B2-Bradykininrezeptors:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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2011
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FUER DEN AUSTAUSCH
AUS DER ABTEILUNG FUER KLINISCHE CHEMIE UND KLINISCHE BIOCHEMIE IN DER
CHIRURGISCHEN KLINIK UND POLIKLINIK - INNENSTADT
DER LUDWIG-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET MUENCHEN
LEITUNG: PROF. DR. RER. NAT. DR. MED. HABIL. MARIANNE JOCHUM
BEDEUTUNG DER SS-ARRESTINE UND DER G-PROTEIN-GEKOPPELTEN
REZEPTORKINASEN FUER DIE REGULATION DES HUMANEN B 2 -BRADYKININREZEPTORS
DISSERTATION
ZUM ERWERB DES DOKTORGRADES DER MEDIZIN
AN DER MEDIZINISCHEN FAKULTAET DER
LUDWIG-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET ZU MUENCHEN
VORGELEGT VON
MARKUS WIRTH
AUS WUERZBURG
2011
A
19 297
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN HTTP://D-NB.INFO/1010148508
DIGITALISIERT DURCH
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS I
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS V
A ZUSAMMENFASSUNG 1
B EINLEITUNG 4
B.L G-PROTEIN-GEKOPPELTE REZEPTOREN UND G-PROTEINE 4
B. 1.1 G-PROTEIN-GEKOPPELTE REZEPTOREN 4
B.L.L EINTEILUNG DER G-PROTEIN-GEKOPPELTEN REZEPTOREN 4
B.L.2 DIE G-PROTEINE 6
B. 1.3 DESENSIBILISIERUNG UND INTEMALISIERUNG VON G-PROTEIN-GEKOPPELTEN
REZEPTOREN 7
B.2 KININ-KALLIKREIN SYSTEM 8
B.2.1 KININE 8
B.2.2 B 2-BRADYKININREZEPTOR 9
B.3 SIGNALTRANSDUKTION UND REGULATION DES B2-BRADYKININREZEPTORS 10
B.3.1 SIGNALTRANSDUKTION DES B 2-BRADYKININREZEPTORS 10
B.3.2 DESENSIBILISIERUNG UND INTEMALISIERUNG DES B 2-BRADYKININREZEPTORS
10
B.4 G-PROTEIN-GEKOPPELTE REZEPTORKINASEN UND ARRESTINE 12
B.4.1 ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER G-PROTEIN-GEKOPPELTEN REZEPTORKINASEN
UND IHRER BEDEUTUNG FUER
DIE DESENSIBILISIERUNG UND INTEMALISIERUNG VON G-PROTEIN-GEKOPPELTEN
REZEPTOREN 12
B.4.2 ALLGEMEINE CHARAKTERISTIK DER ARRESTINE UND BEDEUTUNG FUER DIE
DESENSIBILISIERUNG UND
INTERNALISIERUNG VON G-PROTEIN-GEKOPPELTEN REZEPTOREN 14
B.4.3 SIGNALTRANSDUKTION DURCH G-PROTEIN-GEKOPPELTE REZEPTORKINASEN UND
SS-ARRESTINE 17
C FRAGESTELLUNG UND ZIELSETZUNG 20
D MATERIAL UND METHODEN ......,*.......................**.*
..........................* .....^7
D.L MATERIAL 21
D.1.1 GERAETE 21
D.1.2 CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 22
D. 1.2.1 CHEMIKALIEN UND MATERIALIEN FUER MOLEKULARBIOLOGISCHE TECHNIKEN
22
D.L.2.2 CHEMIKALIEN UND MATERIALIEN FUER MIKROBIOLOGISCHE TECHNIKEN 25
D. 1.2.3 CHEMIKALIEN UND MATERIALIEN FUER ZELLBIOLOGISCHE TECHNIKEN 26
D. 1.2-4 CHEMIKALIEN UND MATERIALIEN FUR PROTEINCHEMISCHE TECHNIKEN 26
D. 1.2-5 CHEMIKALIEN UND MATERIALIEN FUER INTERNALISIERUNGSVERSUCHE 28
D.1.3 COMPUTERPROGRAMME 28
INHALTSVERZEICHNIS 11
IMAGE 3
D.2 METHODEN 29
D.2.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 29
D.2.1.1 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 29
D.2.1.2 EINFUEGEN VON SCHNITTSTELLEN FUER RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 29
D.2.1.3 ORTSSPEZIFISCHE MUTAGENESE 30
D.2.1.4 DNA-VERDAU MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 32
D.2.1.5 AUFTRENNUNG VON DNA-FRAGMENTEN MITTELS AGAROSEGELELEKTROPHORESE
33
D.2.1.6 DNA-EXTRAKTION AUS DEM AGAROSEGEL 33
D.2.1.7 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN 34
D.2.1.8 TRANSFORMATION CHEMISCH KOMPETENTER K CO//-ZELLEN 34
D.2.1.9 KULTIVIERUNG TRANSFORMIERTER K CO//-STAEMME 34
D.2.1.10 KOLONIE-PCR 34
D.2.1.11 ISOLIERUNG VON DNA AUS K COH 35
D.2.1.12 BESTAETIGUNG DER KORREKTHEIT DER DNA-SEQUENZ 35
D.2.1.13 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA 35
D.2.2 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 37
D.2.2.1 KULTIVIERUNG VON HEK293-ZE EN 37
D.2.2.2 EINFRIEREN UND AUFTAUEN VON SAEUGETIERZELLEN .37
D.2.2.3 DASF// /N N R-AECNN -EXPRESSIONSSYSTEM 37
D.2.2.4 TRANSFEKTION VON HEK293-ZEUEEN 39
D.2.2.5 TRANSIENTE TRANSFEKTION VON HEK293-ZEL EN 39
D.2.2.6 LIPOFEKTION VON SIRNA 39
D.2.2.7 INTRAZELLULAERE CA 2*-MOBILISATION 40
D.2.2.8 INTEMALISIERUNG 40
D.2.3 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 41
D.2.3.1 ISOLIERUNG VON ZYTOPLASMAPROTEINEN 41
D.2.3.2 PROTEINNACHWEIS MITTELS WESTERN BLOT 41
D.2.3.3 DETEKTION DER ERKL/2-AKTIVIERUNG 42
D.2.3.4 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION 43
D.2.4 EPIFLUORESZENZ MIKROSKOPIE 43
D.2.5 DATENANALYSE 43
E ERGEBNISSE 44
E.1 ABHAENGIGKEIT DER INTEMALISIERUNG DES B 2R VON DEN GRKS UND SS-
ARRESTINEN UND RELEVANZ DES C-TERMINUS ALS ZIELSEQUENZ 44
E L .L ABHAENGIGKEIT DER INTEMALISIERUNG DES B 2R VON VERSCHIEDENEN GRKS
48
EL.1.1 INTEMALISIERUNG NACH KNOCKDOWN DER GRK2 UND 3 MITTELS
RNA-INTERFERENZ 48
EL.1.2 EINFLUSS EINER UEBEREXPRESSION DER GRK2-6 AUF DIE INTEMALISIERUNG
DES B 2WT 50
INHALTSVERZEICHNIS III
IMAGE 4
E. 1.1.3 IDENTIFIZIERUNG C-TERMINALER ZIELSEQUENZEN FUER DIE
INTEMALISIERUNG DES B 2RDURCH GRK2-6... 52
E. 1.1.4 INTEMALISIERUNGSZEITKURVE VON GRK2 UND 3 UEBEREXPRIMIERENDEN
HEK293-ZE EN NACH
TRANSIENT» TRANSFEKTION MIT T345*, N338*, G327* UND S/T- E 57
E. 1.2 ABHAENGIGKEIT DER INTEMALISIERUNG VON DEN SS-ARRESTINEN 58
E. 1.2.1 INTEMALISIERUNG NACH KNOCKDOWN VON SS-ARRL UND 2 58
E. 1.2.2 INTEMALISIERUNGSZEITKURVE NACH KNOCKDOWN VON SS-ARRL UND 2 IN
STABIL B 2WT, S339A UND
T345* EXPRIMIERENDEN HEK293-ZE LEN 60
E.L.2.3 EINFLUSS DER UEBEREXPRESSION VON SS-ARRL UND 2 AUF DIE
INTEMALISIERUNG DES B 2WT 62
E. 1.2.4 BEDEUTUNG DES C-TERMINUS FUER DIE INTEMALISIERUNG DES B 2R DURCH
SS-ARRESTINE ...64
E. 1.2.5 INTEMALISIERUNGSZEITKURVE NACH TRANSIENTER TRANSFEKTION VON
STABIL SS-ARRL UND 2 EXPRIMIERENDEN
/FFIK29J-ZELLENMITT345*,N338*, G327* UND S/T- E 68
E. 1.3 BEDEUTUNG DES PHOSPHORYLIERUNGSSENSORS UND DER
CLATHRINBINDUNGSSTELLE FLIR DIE FUNKTION DER
SS-ARRESTINE BEIM B 2R 70
E.L.3.1 HERSTELLUNG VON STABIL SS-ARRLR169E, SS-ARRLR363 SS-ARR2R170EUND
SS-ARR2R357 4
EXPRIMIERENDEN HEK293-ZE]LEN 70
E. 1.3.2 RELEVANZ DES *PHOSPHORYLIERUNGSSENSORS UND DER
CLATHRINBINDUNGSSTELLE FUER DIE
INTEMALISIERUNGSFIINKTION DER SS-ARRESTINE BEIM B 2R 71
E1.3.3 BEDEUTUNG DES C-TERMINUS DES B 2R FUER DIE INTERNALISIERUNG DURCH
PHOSPHORYLIERUNGSUNABHAENGIGE UND CLATHRINBINDUNGSDEFIZIENTE SS-ARRESTINE
72
E.2 BEDEUTUNG DER GRKS UND SS-ARRESTINE FUR DIE SIGNALTRANSDUKTION UND
DESENSIBILISIERUNG DES B 2R 77
E.2.1.1 ABHAENGIGKEIT DES ERKL/2-SIGNALS VON DEN GRKS 77
E.2.1.2 ABHAENGIGKEIT DES CALCIUMSIGNALS VON GRK2,3 UND 5 79
E.2.2 ABHAENGIGKEIT DER DESENSIBILISIERUNG UND SIGNALTRANSDUKTION DES B
2R VON SS-ARRL UND 2 81
E2.2.1 BEEINFLUSSUNG DES ERKL/2-SIGNALS DURCH SS-ARRL UND 2 81
E.2.2.2 ABHAENGIGKEIT DES CALCIUMSIGNALS VON SS-ARRL, SS-ARR2, SS-ARRLR169E
UND SS-ARR2R170E 82
F DISKUSSION 85
F.L ABHAENGIGKEIT DER INTERNALISIERUNG DES B 2R VON DEN GRKS UND SS-
ARRESTINEN UND RELEVANZ DES C-TERMINUS ALS ZIELSEQUENZ............ 85 F.
1.1 ABHAENGIGKEIT DER INTEMALISIERUNG DES HUMANEN B 2R VON DEN GRKS UND
SS-ARRESTINEN 85 F. 1.2 IDENTIFIKATION C-TERMINALER ZIELSTRUKTUREN FUER
DIE LNTERNALISIERUNGSFUNKTION DER GRKS UND SS-
ARRESTINE 87
F. 1.3 RELEVANZ DES *PHOSPHORYLIERUNGSSENSORS UND DER
CLATHRINBINDUNGSSTELLE FUER DIE
LNTERNALISIERUNGSFUNKTION DER SS-ARRESTINE BEIM B 2R 94
F.2 ABHAENGIGKEIT DER DESENSIBILISIERUNG UND SIGNALTRANSDUKTION DES B 2U
VON
GRKS UND SS-ARRESTINEN 97
INHALTSVERZEICHNIS IIII
IMAGE 5
F.2.1 DESENSIBILISIERUNG DES B 2R DURCH GRKS UND SS-ARRESTINE 97
F.2.2 ABHAENGIGKEIT DER ERKL/2-SIGNALTRANSDUKTION VON GRKS UND
SS-ARRESTINEN 98
G RESUEMEE UND AUSBLICK 100
H LITERATURVERZEICHNIS 103
1 DANKSAGUNG / //
INHALTSVERZEICHNIS IIV
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