Molekulare Charakterisierung PK-interagierender Proteine (ZIP): Genstruktur, Expression und Bindepartner
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2010
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1.
ZUSAMMENFASSUNG
............................................................................................................
7
2.
EINLEITUNG
............................................................................................................................
8
2.1.
NAMENSGEBUNG
DES
STAP/A170/ZIP/P62/SQSTM1
-PROTEINS
...........................
8
2.2.
BEKANNTE
ISOFORMEN
UND
PROTEIN-DOMAENEN/REGIONEN
VON
ZIP
.......................
9
2.3.
ZIP
IN
SIGNALWEGEN
UND
ERKRANKUNGEN
...............................................................
9
2.4.
DIE
VERBINDUNG:
AUTOPHAGIE
-
ZIP
-
SPARTIN
-
LIPID
DROPLETS
........................
12
2.4.1.
DIE
DEGRADATIONSWEGE
DER
ZELLE
UND
DIE
BETEILIGUNG
VON
ZIP
........
12
2.4.2.
LDS
UND
SPARTIN
...................................................................................
13
2.4.3.
DIE
VERBINDUNG
....................................................................................
14
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
..................................................................................................
15
3.1.
MATERIAL
..............................................................................................................
15
3.1.1.
CHEMIKALIEN
UND
REAGENZIEN
15
3.1.2.
REAGENZSYSTEME
UND
VERBRAUCHSMATERIALIEN
...................................
18
3.1.3.
ENZYME
UND
STANDARDS
.......................................................................
18
3.1.4.
BIOLOGISCHES
MATERIAL
..........................................................................
19
3.1.5.
KULTURMEDIEN,
PUFFER
UND
LOESUNGEN
...................................................
19
3.1.6.
NUKLEINSAEUREN
......................................................................................
23
3.1.7.
ANTIKOERPER
............................................................................................
25
3.2.
METHODEN
...........................................................................................................26
3.2.1.
STANDARDMETHODEN
..............................................................................
26
3.2.2.
KULTIVIERUNG
DER
HEK293-ZELLLINIE
......................................................
26
3.2.3.
RNA-ISOLIERUNG
....................................................................................
.26
3.2.4.
CDNA-SYNTHESE
..................................................................................
27
3.2.5.
HERSTELLUNG
VON
ANTIKOERPERN
GEGEN
ZIP3
DER
RATTE
(PINEDA)
............
27
3.2.6.
PROTEINEXTRAKTION
AUS
HEK293-ZELLEN
UND
GEWEBEN
.......................
.28
3.2.7.
IMMUNOPRAEZIPITATION
...........................................................................
.28
3.2.8.
FIXIEREN
UND
ANTIKOERPERFAERBUNG
VON
HEK293-ZELLEN
.........................
29
3.2.9.
CHARAKTERISIERUNG
VON
LDS
UEBER
OIL
RED-FAERBUNG
............................
29
3.2.10.
RETINA-ANTIKOERPERFAERBUNG
.................................................................
.29
3.2.11.
GEWINNUNG
VON
PROTEINEXTRAKTEN
AUS
BL21
E.COLI_
.........................
30
3.2.12.
GST-PULLDOWN-EXPERIMENT
...............................................................
30
3.2.13.
YEAST-TWO-HYBRID
..............................................................................
31
3.2.14.
COMPUTERANWENDUNGEN
....................................................................
34
4.
ERGEBNISSE
........................................................................................................................
35
4.1.
EXON
/
INTRONSTRUKTUR
DER
ZIP-LSOFORMEN
IN
DER
RATTE
......................................
35
4.2.
ZIP-DNA-SEQUENZ
VON
INTRON
4
BEI
RATTE,
MAUS,
MENSCH
UND
RIND
.............
36
4.3.
VERKUERZTE
ZIP-TRANSKRIPTE
BEI
RATTE
UND
MENSCH
..........................................
37
4.4.
HERSTELLUNG
SPEZIFISCHER
ANTIKOERPER
GEGEN
ZIP3
DER
RATTE
..............................
39
4.5.
ZIP3-PROTEIN
IN
GEWEBEN
DER
RATTE
UND
ZELLSPEZIFITAET
IN
DER
RETINA
..............
41
4.6.
IDENTIFIZIERUNG
NEUER
INTERAKTIONSPARTNER
VON
ZIP3
DER
RATTE
..........................
46
4.6.1.
CHARAKTERISIERUNG
DER
BOVINEN
RETINALEN
CDNA-BIBLIOTHEK
..............
.46
4.6.2.
HEFETRANSFORMATION
UND
BESTIMMUNG
DER
3-AT-KONZENTRATION
.......
47
4.6.3.
YEAST-TWO-HYBRID
SCREEN
49
4.6.4.
DIREKTE
INTERAKTION
ZWISCHEN
ZIP1-3
UND
ENO1,
CPE,
DAXX,
MEGF8,
SPG20
..................................................................................
50
4.6.5.
HINTERGRUENDE
ZU
DEN
INTERAKTIONSPARTNERN
ENO1,
DAXX,
MEGF8
UND
SPG20
.........................................................................................
52
4.6.6.
AUSWAHL
VON
SPG20
(SPARTIN)
ZUR
WEITEREN
CHARAKERISIERUNG
........
53
4.7.
BINDUNGSVERMITTELNDE
REGIONEN
BEI
DER SPARTIN/ZIP-INTERAKTION
....................
54
4.7.1.
CO-IMMUNOPRAEZIPITATION
DER
SPARTIN
UND
ZIP-KONSTRUKTE
...............
54
4.7.2.
CO-LOKALISATION
VON
ZIP
UND
SPARTIN
IN
HEK293-ZELLEN
...................
55
4.8.
ZELLULAERE
ERSCHEINUNGSFORM
VON
ZIP
UND
SPARTIN
.............................................
57
4.9.
SPARTIN
REKRUTIERT
ZIP1
UND
ZIP3
AN
LDS
...........................................................
58
4.10.
GROESSENWACHSTUM
VON
LDS
DURCH
PKCC/ZIP/SPARTIN-INTERAKTION
..................
59
5.
DISKUSSION
.........................................................................................................................
62
5.1.
SPLEISS-MECHANISMEN,
DIE
ZUR
ZIP2
UND
ZIP3-LSOFORM
DER
RATTE
FUEHREN
......
62
5.2.
POLY(A)-SIGNALE
IM
INTRON
4
ALS
AUSLOESER
KURZER
ZIP-VARIANTEN
......................
63
5.3.
GERINGE
ZIP3-PROTEINMENGE
IN
VIELEN
GEWEBEN
DER
RATTE
.............................
65
5.4.
ZIP3
IST
IN
SPEZIFISCHEN
ZELLEN
DER
RETINA
EXPRIMIERT
.......................................65
5.5.
NEUE
ZIP-INTERAKTIONSPARTNER
BINDEN
AN
REGIONEN
VON
ZIP3
.........................66
5.6.
DIE
FRAGE
NACH
ZIP3-SPEZIFISCHEN
BINDEPARTNERN
............................................67
5.7.
SPARTIN,
EIN
ZIP3-SPEZIFISCHER
INTERAKTIONSPARTNER?
.........................................
67
5.8.
UEBERLEGUNGEN
ZUR
ZELLULAEREN
ERSCHEINUNG
VON
ZIP-LSOFORMEN
........................
68
5.9.
SPARTIN
REKRUTIERT
BEVORZUGT
ZIP3
AUF
DIE
OBERFLAECHE
VON
LDS........................
69
5.10.
DIE
PKCC/ZIP/SPARTIN-INTERAKTION
ALS
AUSLOESER
EINER
LD-FUSION
..................
69
6.
ABKUERZUNGEN
....................................................................................................................
72
7.
LITERATURVERZEICHNIS
75
8.
PUBLIKATIONEN
....................................................................................................................
85
9.
ANHANG
...............................................................................................................................
86
10.
DANKSAGUNG
....................................................................................................................
87
|
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