Mechanismen der Zellspezifizierung im weiblichen Gametophyten von Arabidopsis thaliana:
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| adam_text | Titel: Mechanismen der Zellspezifizierung im weiblichen Gametophyten von Arabidopsis thaliana
Autor: Lyncker-Ehrenkrook, Ludwig von
Jahr: 2010
Inhaltsverzeichnis
Danksagungen 5
Inhaltsverzeichnis___7
Abbildungsverzeichnis ______________________________12
Tabellenverzeichnis _ 14
Abkürzungsverzeichnis__15
Zusammenfassung__17
E Einleitung____ 20
E.1 Der Gametophyt ist arbeitsteilig organisiert_ 22
E 2 Mechanismen der Zelldifferenzierung im Gametophyten_ 24
E 3 Gestörte Musterbildung in der lachesis Mutanten 26
E.4 Auxinabhängige Musterbildung im Gametophyten_ 27
E.5 Vor- und Nachteile des weiblichen Gametophyten als Modellsystem 27
E 6 Ziel dieser Arbeit _ 28
1 Kapitel 1
Manuskript
Egg cell integrity is necessary for cell differentiation in the female
gametophyte and endosperm formation__29
1.1 Abstract__30
1.2 Introduction__31
1.3 Results and Discussion__32
1.3.1 LIS is a non-mobile protein and preferentially accumulates in gametic cells 32
Constitutive lis (RNAi) lines show reduced LIS mRNA levels and growth
1.3.2 retardation___ 35
Reduced LIS expression in the egg cell compromises the development of all
13 3 female gametophytic cells____________________________________
1 3 4 LIS is required in qametic and accessory cells in a cell autonomous manner 42
1.3.5 The lis defect can be rescued by introducing LIS only after cellularization 43
1 4 Acknowledgements 46
15 Materials and Methods 46
16 Supporting Information 50
1 7 Zusatzliche Ergebnisse 56
1.7.1 Korrelationsanalyse der zellspezifischen lis Defekte 56
2 Kapitel 2
Auxin im weiblichen Gametophyten ___59
2 1 Einleitung_60
2.1.1 Auxin reguliert in der Pflanze eine Vielzahl von Prozessen_ 60
2.1.2 Zwei zentrale Proteinfamilien der Auxinantwort: Die ARF- und Aux/IAA-Familie 61
2.1.3 Auxinabhängige Musterbildung im Gametophyten_ 63
2.2 Ergebnisse__64
2.2.1 DR5 Expression und PIN1 Lokalisation ___ 64
Aux/IAA15 und Aux/IAA 10 sind spezifisch im weiblichen Gametophyten
2.2.2 exprimiert_ 67
2.2.3 Expression von aux/iaa 15 führt zu keinen auffälligen Phänotypen_ 69
Phänotypen im reifen Gametophyten durch spezifische Aux/IAA15
2.2.4 Überexpression bzw. ektopische Expression_ 70
2.2.5 Frühe Expression von aux/iaa 15 zeigt auffällige Linien_ 71
2 2 6 Kein Effekt bei synergidenspezifischer aux/iaalO Expression_ 78
2.2 7 ARF Proteine sind in der Ovule und im Gametophyten differenziell exprimiert 78
2.2.8 Manipulation des weiblichen Gametophyten mit der cDNA von ARF9_ 79
229
Schwache ARF12 Expression in der Eizelle führte zu keinem Effekt
85
3
3 1
32
3 3
3 4
.1
.2
.2 1
2 2
,23
.3
.1
.2
.2.1
2.2
.3
1.1
1.2
2 1
¦riria lSserjeiCMn.s
Diskussion_________85
Unterschiede der DR5 und PIN1 Expressionsanalyse zu publizierten
Beobachtungen_____ . . . ... 85
Möglicher Dosiseffekt von Aux/1AA15 bei Uberexpression__86
Vergleich der Aux/IAA 15 Überexpression mit der YUCCA2 Überexpression__87
Differenzielle ARF Expression fuhrt zu drei gametophytischen
Expressionsprofilen___88
Kapitel 3
Analyse des Aux/IAA 13 Promotors _91
Einleitung ________ 92
Ergebnisse ______ 92
Verkürzung des Promotors auf 437bp und digitale Analyse 92
MADS A und MASD B Bindestellen________ 93
170bp sind für Expression in der Eizelle notwendig ____ 98
Diskussion __________ 98
KAPITEL 4
Ovulenkulturen___________________________101
Einleitung_________ _ 102
Ergebnisse______ __________________102
Der .Female Gametophyte Reporter 6.0 von Ronny Vòlz __ 102
Ovulenkullurmedien______ ____ ________106
Diskussion___________112
Kapitel 5
Mikroinjektion_________
Einleitung ____________ 11®
Ergebnisse_ 117
Zentralzell- und Eizellinjektion ____________ 117
9
5 2 2
5 2 3
52 4
5.2.5
5 2.6
5.2 7
528
5 3
6
6.1
6 2
7
7.1
7.2
7 3
7.3.1
732
7 3.3
7.4
7.4.1
7.4.2
74.3
7.4.4
7.4.5
7.5
7 6
7.7
Injektion in weitere Zellen__________________________ ______________ 121
Moleküldurchlässigkeit im weiblichen Gametophyten ___ 122
ATP Injektionen in die Zentralzelle_ 123
Auxininjektionen in die Zentralzelle____________126
Ablationsexperimente 128
Eizellablation_ 128
Zentralzellablation __ 131
Diskussion___________ 132
Diskussion _______________1^7
LIS abhängige Zell-Zell Kommunikation im weiblichen Gametophten_ 137
Ausblick______________
Material und Methoden _______ 142
Materialien und Chemikalien 142
Wachstumsbedingungen der Pflanzen und Transformation__142
Histologie und Mikroskopische Techniken_ 142
Analyse von Fluoreszenz im weiblichen Gametophyten_ 142
GUS-Färbungen. Klärpräparate. Sterilitätsanalyse_ 142
Bilderstellunq und Prozessierung 143
Molekularbiologische Methoden_ 143
DNA-Präparation aus Pflanzenmaterial_ 143
PCR-Analysen________________________ 143
mRNA-lsolierung, cDNA-Synthese. Punktmutagenese. __________ 144
Herstellung elektrokompetenter Zellen und Klonierung_ 144
DNA-Bearbeitungsprog ramme ___________________________144
Promotoranalysen _________________________________________144
Ovulenkulturen__ 145
Mikroinjektion
145
7 7 1 Verwendete Glaskapillaren__145
772 Pas Ziehen von Kapillaren am PD-5 Puller von Narishige 146
7 7 3 Einstellungen des Mikroinjektors _ 146
7 7.4 Mikroskop- und Mikromampulator-Einstellungen___147
7 7.5 Injektionslosungen__148
7 7 6 Einbettung von Ovulen auf Platte _ 148
7 7 7 Vitalitatsfärbung auf Platte__150
7 7.8 Das Klären von Ovulen auf Platte_______________________150
Literaturverzeichnis________________1^1
Anhange_______________________________________________________________156
A.1 Verwendete Oligonukleotide__156
A 2 Verwendete Konstrukte__162
A 3 Hergestellte transgene Pflanzenlinien__165
Lebenslauf __166
11
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