Genetische Analyse von Substrat-Translokase-Wechselwirkungen bei der Tat-abhängigen Proteintranslokation in Escherichia coli:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Jülich
Forschungszentrum, Zentralbibliothek
2010
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| Schriftenreihe: | Schriften des Forschungszentrums Jülich
Reihe Gesundheit ; 27 |
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNISS I. EINLEITUNG 1 1. DER GENERELLE SEKRETIONSWEG IN E.
COLI 2 2. DER TAT-WEG 4 2.1 DAS TAT-SIGNALPEPTID 4 2.1.1 DAS
TAT-KONSENSUS-MOTIV S-R-R-X-F-L-K 5 2.1.2 FUNKTION DER TAT-SIGNALPEPTID
H-REGION IN DER TAT-ABHAENGIGEN PROTEINTRANSLOKATION 7 2.1.3 DIE ROLLE
DER C-REGION VON TAT-SIGNALPEPTIDEN UND DES FRUEHEN REIFEN PROTEINTEILS
BEI DER EINHALTUNG DER TAT-EXPORTWEG SPEZIFITAET 8 2.2 DER REIFE
PROTEINTEIL VON TAT-SUBSTRATEN 9 2.3 DER AUSSCHLUSS VON FALSCH
GEFALTETEN TAT-SUBSTRATEN VOM EXPORT 10 2.4 BINDUNG VON GENERELLEN UND
SPEZIFISCHEN CHAPERONEN AN TAT-SUBSTRATE 12 2.5 DER
TAT-TRANSLOKATIONSAPPARAT 14 2.5.1 DIE ENTDECKUNG UND DIE
ZUSAMMENSETZUNG DER TAT-TRANSLOKASE(N) 14 2.5.2 DIE E. COLI TAI-GENE 15
2.5.3 DAS TATA-PROTEIN UND SEINE OLIGOMERISIERUNGSFORMEN 16 2.5.4 DAS
TATB-PROTEIN 19 2.5.5 DAS TATC-PROTEIN 21 2.5.6 DER
TATBC-REZEPTORKOMPLEX 22 2.6 DIE INTERAKTIONEN DER TAT-SIGNALPEPTIDE MIT
DER TAT-TRANSLOKASE 22 2.7 DIE ENERGETISIERUNG DER TAT-ABHAENGIGEN
PROTEINTRANSLOKATION 24 2.8 MODELL ZUM MECHANISMUS DER TAT-ABHAENGIGEN
PROTEINTRANSLOKATION 25 2.9 ZIELSETZUNGEN DIESER ARBEIT 27 II. MATERIAL
UND METHODEN 29 1. CHEMIKALIEN UND ENZYME 29 2. BAKTERIENSTAEMME,
PLASMIDE UND OLIGONUKLEOTIDE 29 3. MIKROBIOLOGISCHE METHODEN 34 3.1
KULTIVIERUNG VON BAKTERIEN 34 3.1. BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/1005280061 DIGITALISIERT DURCH 4. MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN 38 4.1 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA 38 4.2 ALLGEMEINE
MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 38 4.2.1 SPALTUNG VON DNA MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN 38 4.2.2 ENTSALZEN VON DNA 38 4.2.3 FAELLUNG VON DNA
AUS WAESSRIGER LOESUNG (NACH SAMBROOK ET AI, 1989, VERAENDERT) 39 4.2.4
ISOLIERUNG VON DNA AUS AGAROSEGELEN 39 4.2.5 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
39 4.2.6 BEHANDLUNG VON DNA MIT ALKALISCHER PHOSPHATASE 40 4.2.7
LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN 40 4.2.8 POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR)
(SAIKI ET AL., 1988) 40 4.2.9 NICHT RADIOAKTIVE DNA-SEQUENZIERUNG NACH
DER KETTENABBRUCH-METHODE 41 4.2.10 ORTSGERICHTETE MUTAGENESE 41 4.2.11
UNGERICHTETE MUTAGENESE VON DNA-FRAGMENTEN DURCH FEHLERHAFTE
POLYMERASEKETTENREAKTION (,,ERROR-PRONE -PCR) 43 5. PROTEINCHEMISCHE
METHODEN 43 5.1 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE, VARIIERT
NACH LAEMMLI, 1970). 43 5.2 WESTERN-BLOT 45 5.3 PRAEPARATION VON E.
CO/Z-MEMBRANEN 46 5.4 FRAKTIONIERUNG VON E. COLI ZELLEN MITTELS
OSMOTISCHEN SCHOCKS 47 III. ERGEBNISSE 49 1. DAS
TORA-MALE-REPORTERSYSTEM: AUFBAU UND ANWENDUNGSMOEGLICHKEITEN ZUR
UNTERSUCHUNG VON SUBSTRAT-TRANSLOKASE-INTERAKTIONEN BEI DER
TAT-ABHAENGIGEN PROTEINTRANSLOKATION IN. COLI 49 1.1 DAS
TORA-MALE-REPORTERPROTEIN 49 1. 2.5.2 GENETISCHE HINWEISE AUF EINE
KOOPERATION DES TATB N-TERMINUS UND DES TATC N-TERMINUS BEI DER
ERKENNUNG/BINDUNG DES SIGNALPEPTIDS DES TORA[F14D]-MALE- REPORTERS 69
2.5.2.1 DIE PHAENOTYPEN DER STAEMME MIT DEN MUTIERTEN TAT-TRANSLOKASEN
ZEIGEN EINE STEIGERUNG DES TORA[F14D]-MALE EXPORTS DURCH DIE KOMBINATION
VON SUPPRESSORMUTATIONEN 70 2.5.2.2 DER GESTEIGERTE TORA[F14D]-MALE
EXPORT IN DEN STAEMMEN MIT DEN TAT- SUPPRESSORTRANSLOKASEN MIT DEN
PAARWEISE EINGEFUEGTEN SUPPRESSORMUTATIONEN WIRD AUF PROTEINEBENE
BESTAETIGT 75 2.5.3 AUCH DER EXPORT DES TORA[KQ]-MALE-REPORTERS WIRD
DURCH DIE KOMBINATION VON SUPPRESSORMUTATIONEN AUS DEM TATB N-TERMINUS
UND DEM TATC N-TERMINUS GESTEIGERT 79 2.5.3.1 DIE SUPPRESSORTRANSLOKASEN
DES EXPORTDEFEKTES DES TORA[F14D]-MALE- REPORTERS VERMITTELN AUCH DEN
EXPORT DES TORA[KQ]-MALE-REPORTERS 80 2.5.3.2 DIE TAT-TRANSLOKASEN MIT
DEN PAARWEISE EINGEFUEGTEN SUPPRESSORMUTATIONEN ZEIGEN EINEN STARK
GESTEIGERTEN EXPORT DES TORA[KQ]-MALE-REPORTERS 83 2.5.4 UNTERSUCHUNG
ZUM EXPORT DES UNVERAENDERTEN TORA-MALE-REPORTERS DURCH DIE
SUPPRESSORTRANSLOKASEN 87 2.5.4.1 DIE SUPPRESSORTRANSLOKASEN VERMITTELN
AUCH DEN EXPORT DES UNVERAENDERTEN TORA-MALE-REPORTERS 87 2.5.4.2 DIE
SUPPRESSORTRANSLOKASEN MIT DER MUTATION L9Q IN TATB ZEIGEN EINEN
VERRINGERTEN EXPORT DES TORA-MALE-REPORTERS 89 2.6 DIE EFFEKTE VON
EINZELNEN SUPPRESSORMUTATIONEN AUF DEN EXPORTDEFEKT DES TORA[F14D]-MALE-
UND DES TORA[KQ]-MALE-REPORTERS SUMMIEREN SICH AUCH BEI KOMBINATIO 3.5.2
GENETISCHE HINWEISE AUF BEREICHE IN TATB UND IN TATC DIE AN DER
INTERAKTION VON TATB UND TATC IM TATBC-REZEPTORKOMPLEX BETEILIGT SIND
117 3.5.2.1 SOWOHL IN DER P48A-S-UM4- ALS AUCH IN DER P48A-S-UM5-
URSPRUNGSSUPPRESSORTRANSLOKASE IST DIE VOLLE SUPPRESSION JEWEILS DURCH
DIE KOMBINATION VON ZWEI P48A-SUPPRESSORMUTATIONEN BEDINGT 117 3.5.2.2
DIE UNTERSUCHUNG ZUM EXPORT DES TORA-MALE-REPORTERS DURCH DIE P48A-
SUPPRESSORTRANSLOKASEN AUF PROTEINEBENE BESTAETIGT, DASS IN P48A-S-UM4
UND IN P48A-S-UM5 JEWEILS BEIDE SUPPRESSORMUTATIONEN ZUSAMMEN FUER DIE
VOLLE SUPPRESSION VERANTWORTLICH SIND 122 IV. DISKUSSION 127 1.
SUBSTRAT-TRANSLOKASE-INTERAKTION WAEHREND DER TAT-ABHAENGIGEN
PROTEINTRANSLOKATION... 127 1.1 DIE AMINOSAEURE AN DER
PHENYLALANIN-POSITION IM TAT-KONSENSUS-MOTIV KANN EINE KRITISCHE
DETERMINANTE FUER DIE FUNKTIONALITAET DES TORA-SIGNALPEPTIDES DARSTELLEN
128 1.2 DIE SUPPRESSORMUTATIONEN DES EXPORTDEFEKTES DES
TORA[KQ]-REPORTERS SUPPRIMIEREN AUCH DEN EXPORTDEFEKT DES
TORA[F14D]-REPORTERS 131 1.3 ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON
SUPPRESSORTRANSLOKASEN DES EXPORTDEFEKTES DES TORA[F14D]-MALE-REPORTERS
132 1.3.1 DIE SUPPRESSORMUTATIONEN DES EXPORTDEFEKTES DES
TORA[F14D]-MALE-REPORTERS FINDEN SICH, WIE DIE SUPPRESSORMUTATIONEN DES
EXPORTDEFEKTES DES TORA[KQ]-MALE- REPORTERS, IN DEN N-TERMINI VON TATB
UND TATC 132 1.3.2 ALLE ISOLIERTEN SUPPRESSORMUTATIONEN DES
EXPORTDEFEKTES DES TORA[F14D]- MALE-UND DES EXPORTDEFEKTES DES
TORA[KQ]-MALE-REPORTERS VERMITTELN AUCH EINEN EXPOR 2. GENETISCHE
UNTERSUCHUNGEN ZU WECHSELWIRKUNGEN INNERHALB DER TAT-TRANSLOKASE 150 2.1
DIE TAT-INAKTIVIERENDE MUTATION P48A IN TATC ALS AUSGANGSPUNKT ZUR
UNTERSUCHUNG VON WECHSELWIRKUNGEN ZWISCHEN TATB UND TATC IN DER
TAT-TRANSLOKASE 151 2.2 GENETISCHE HINWEISE FUER EINE BETEILIGUNG DER
TATB-TRANSMEMBRANHELIX, EINES BEREICHS IN DER CYTOPLASMATISCHEN DOMAENE
VON TATB UND DES EXTREMEN N-TERMINUS VON TATC, AN DER INTERAKTION VON
TATB UND TATC IM TATBC-REZEPTORKOMPLEX 153 V. ZUSAMMENFASSUNG 159 VI.
SUMMARY 161 VII. LITERATUR 163
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