Analyse der Heteromerisierung von hyperpolarisationsaktivierten und zyklisch Nukleotid-gesteuerten Ionenkanälen (HCN-Kanälen):
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Caesar [u.a.]
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| adam_text | Titel: Analyse der Heteromerisierung von hyperpolarisationsaktivierten und zyklisch Nukleotid-gesteuerten I
Autor: Aho, Annukka Mirjami
Jahr: 2010
I Inhaltsverzeichnis
I Inhaltsverzeichnis
i inhaltsverzeichnis.............................................................................................................i
ii abkürzungsverzeichnis..................................................................................................v
1 Einleitung.............................................................................................................................1
1.1 HCN-Kanäle: Eigenschaften......................................................................................................................1
1.2 HCN-Kanäle: Expression...........................................................................................................................6
1.3 HCN-Kanäle: Funktion..............................................................................................................................8
1.3.1 Generierung / Modulation spontaner rhythmischer Aktivität im Gehirn..............................................9
1.3.2 Modulation der Kabeleigenschaften eines Neurons............................................................................11
1.3.3 Regulation der synaptischen Transmission.........................................................................................12
1.3.4 HCN knock-out Mausmodelle.............................................................................................................13
1.4 Zielsetzung der Arbeit..............................................................................................................................15
2 Material und Methoden.................................................................................................17
2.1 Material.....................................................................................................................................................17
2.2 E.coli Zellkultur.......................................................................................................................................18
2.2.1 Verwendete Bakterienstämme und Plasmidvektoren..........................................................................18
2.2.2 Zusammensetzung und Herstellung der Kulturmedien für E. coli......................................................19
2.2.3 Anzucht von E. coli Bakterienkulturen...............................................................................................20
2.2.3.1 Anzucht von E. coli Zellen zur Plasmidpräparation....................................................................20
2.2.3.2 Herstellung kompetenter Zellen zur Transformation mit Plasmid-DNA....................................20
23 DNA-Präparationen.................................................................................................................................20
2.3.1 Präparation von genomischer DNA aus Mausgewebe........................................................................20
2.3.2 Plasmid-DNA-Präparationen..............................................................................................................21
2.3.2.1 Alkalische Mega-Präparation......................................................................................................21
2.3.2.2 Qiagen Plasmidpräparation.........................................................................................................22
2.4 Reinigung und Trennung von Nukleinsäuren........................................................................................22
2.4.1 Phenol/Chloroform-Extraktion...........................................................................................................22
2.4.2 Ethanol-Präzipitation..........................................................................................................................23
2.4.3 Quantifizierung von Nukleinsäuren....................................................................................................23
2.4.3.1 Photometrische Bestimmung der Nukleinsäurekonzentration.....................................................23
2.4.3.2 Konzentrationsbestimmung mit Hilfe von Agarosegelen............................................................24
2.4.4 Auftrennung von DNA in Agarosegelen.............................................................................................24
2.4.5 DNA-Größen- und Mengenstandards.................................................................................................25
2.5 Manipulation von Nukleinsäuren............................................................................................................25
2.5.1 Restriktion von Plasmid-DNA mit Restriktionsendonukleasen..........................................................25
2.5.2 Retransformation.................................................................................................................................26
2.6 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)..........................................................................................................26
I Inhaltsverzeichnis
2.7 Heterologe Genexpression in HEK293-Zellen........................................................................................27
2.7.1 Kulturbedingungen für HEK293-Zellen.............................................................................................27
2.7.2 Transiente Expression von Proteinen in HEK293-Zellen...................................................................29
2.7.2.1 Transfektion nach der CaP04-Methode.......................................................................................29
2.7.2.2 Transfektion mittels ?Lipofectamine LTX ................................................................................30
2.7.3 Stabile Expression von Proteinen in HEK293-Zellen.........................................................................31
2.8 Versuchstiere.............................................................................................................................................32
2.9 ZelI-/Gewebepräparationen.....................................................................................................................33
2.9.1 Zellernte adhärent wachsender HEK293-Zellen.................................................................................33
2.9.2 Präparation von Mausgewebe.............................................................................................................34
2.9.2.1 Präparation von Hirngewebe der Maus.......................................................................................34
2.9.2.2 Präparation anderer Organe der Maus.........................................................................................35
2.10 Präparation von Membranproteinen....................................................................................................35
2.10.1 Präparation von Membranproteinen aus HEK293-Zellen.................................................................35
2.10.2 Präparation von Membranproteinen aus Mausgewebe.....................................................................36
2.11 Quantifizierung von Proteinen..............................................................................................................37
2.11.1 Konzentrationsbestimmung nach Bradford( 1976)...........................................................................37
2.11.2 Konzentrationsbestimmung mit Amidoschwarz...............................................................................37
2.11.3 Konzentrationsbestimmung mit Bicinchoninsäure (BCA)................................................................38
2.12 Deglykosylierung von Membranproteinen...........................................................................................39
2.13 Trennung von Proteinen durch Gelelektrophorese.............................................................................39
2.13.1 Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)............................................39
2.13.2 Verwendete Protein-Größenstandards..............................................................................................40
2.13.3 Bestimmung der Molekülmasse mittels SDS-PAGE........................................................................42
2.13.4 Färben von SDS-Polyacrylamid-Gelen mit Coomassie-Lösung.......................................................42
2.14 Nachweis spezifischer Proteine..............................................................................................................43
2.14.1 Transfer und Immobilisierung von Proteinen (?Western-Blot ).......................................................43
2.14.2 Immunologischer Nachweis von immobilisierten Proteinen............................................................43
2.14.3 Entfernung von primären und sekundären Antikörpern (?Strippen )...............................................45
2.14.4 Densitometrisehe Auswertung (?AIDA Image Analyzer )...............................................................46
2.14.5 Amidoschwarz-Färbung der Membran.............................................................................................46
2.15 Immunfluoreszenz..................................................................................................................................47
2.15.1 Immunzytochemische Färbung von HEK293-Zellen........................................................................47
2.15.2 Immunhistochemische Färbungen....................................................................................................49
2.15.2.1 Perfusion...................................................................................................................................49
2.15.2.2 Anfertigen von Gefrierschnitten................................................................................................50
2.15.2.3 Immunhistochemische Färbungen von Gefrierschnitten...........................................................50
2.15.3 Ko-Lokalisationsanalyse...................................................................................................................51
2.16 Verwendete Antikörper..........................................................................................................................52
2.16.1 Erstantikörper....................................................................................................................................52
2.16.2 Aufreinigung von polyklonalen Antiseren über Peptidsäulen...........................................................53
2.16.3 Zweitantikörper.................................................................................................................................54
2.17 Affinitätschromatographie an einer Antikörper-Säulenmatrix.........................................................55
2.17.1 Immobilisierung von monoklonalen Antikörpern an Protein G-Sepharose......................................55
2.17.2 Ko-Immunpräzipitation.....................................................................................................................56
2.17.3 Bestimmung der Ausbeute einer Ko-Immunpräzipitation................................................................57
2.18 Elektrophysiologische Untersuchung der heterolog exprimierten HCN-Kanäle..............................57
I Inhaltsverzeichnis III
3 Ergebnisse...........................................................................................................................59
3.1 Solubilisierung von HCN-Kanalproteinen.............................................................................................59
3.2 Nachweis von HCN-Kanälen in HEK293-Zellen und in Hirngeweben der Maus...............................63
3.2.1 Expression und Glykosylierung von HCN-Kanälen in HEK293-Zellen.............................................63
3.2.1.1 Immunzytochemische und biochemische Charakterisierung der stabilen rHCN-Linien.............63
3.2.1.2. Glykosylierung von HCN-Kanälen in HEK293-Zellen.............................................................68
3.2.2 Expression und Glykosylierung von nativen HCN-Kanälen im Gehirn der Maus.............................73
3.3 Funktionelle Expression von HCN3 in HEK293-Zellen........................................................................81
3.3.1 Expression von heterolog exprimiertem HCN3-Protein in der Plasmamembran................................81
3.3.2 Charakterisierung der doppeltstabilen HEK293-Linien rHCNl/3 und rHCNl/3HA..........................86
3.4 Elektrophysiologische Charakterisierung heterolog exprimierter HCN-Kanäle................................91
3.5 Ko-Immunpräzipitation von heterolog exprimierten HCN-Kanälen..................................................96
3.6 Ko-Immunpräzipitation von nativen HCN-Kanälen aus Hirngeweben der Maus...........................100
3.6.1 Ergebnisse.........................................................................................................................................100
3.6.2 Zusammenfassung.............................................................................................................................118
4 Diskussion.........................................................................................................................121
4.1 Heteromere HCN-Kanäle.......................................................................................................................122
4.1.1 Heteromere HCN-Kanäle im heterologen Expressionssystem..........................................................122
4.1.2 Heteromere HCN-Kanäle im Gehirn................................................................................................123
4.1.3 Mögliche Ursachen der geringen Ausbeuten bei Ko-Immunpräzipitationen mit nativem Gewebe.. 124
4.2 Bindeproteine und zusätzliche Untereinheiten (auxiliary subunits)...................................................125
4 J Ausblick I: Weitere Untersuchungen an heteromeren HCN-Kanäle.................................................128
4.3.1 Untersuchung der Plasmamembranexpression mittels unroofing.....................................................128
4.3.2 Bestimmung der Stöchiometrie von HCN-Kanälen: FRET + TIRF.................................................131
4.4 Ausblick II: Bedeutung und Funktion heteromerer HCN-Kanäle.....................................................133
5 LITERATURVERZEICHNIS....................................................................................................135
6 ANHANG...............................................................................................................................147
6.1 Ergebnisse zur Expression der vier HCN-Isoformen im Gehirn........................................................147
6.2 Aminosäuresequenzvergleich der mHCN-Isoformen..........................................................................148
6.3 In dieser Arbeit verwendete Plasmide..................................................................................................151
6.4 In dieser Arbeit verwendete Primer......................................................................................................152
6.5 HCN-Antikörper und die Lokalisation der jeweiligen Antigene........................................................152
6.6 Qualitative Beschreibung der Ko-Immunpräzipitationen von nativen HCN-Kanälen....................153
6.7 Übersicht über die Quantifizierung der Ko-Immunpräzipitationen..................................................154
6.7.1 Ausbeuten vor der Normalisierung...................................................................................................154
6.7.2 Ausbeuten nach der Normalisierung.................................................................................................155
6.8 Immunhistochemisch nachgewiesene Kombinationen von HCN-Heteromeren................................156
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