Analyse der Heteromerisierung von hyperpolarisationsaktivierten und zyklisch Nukleotid-gesteuerten Ionenkanälen (HCN-Kanälen):
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
[Bonn]
Caesar [u.a.]
2010
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | XII, 156 S. Ill., graph. Darst. |
Internformat
MARC
| LEADER | 00000nam a2200000 c 4500 | ||
|---|---|---|---|
| 001 | BV036721788 | ||
| 003 | DE-604 | ||
| 005 | 20110413 | ||
| 007 | t | ||
| 008 | 101015s2010 ad|| m||| 00||| ger d | ||
| 035 | |a (OCoLC)705906254 | ||
| 035 | |a (DE-599)HBZHT016419244 | ||
| 040 | |a DE-604 |b ger |e rakwb | ||
| 041 | 0 | |a ger | |
| 049 | |a DE-355 |a DE-188 |a DE-83 | ||
| 088 | |a Caesar 00004 | ||
| 100 | 1 | |a Aho, Annukka |e Verfasser |4 aut | |
| 245 | 1 | 0 | |a Analyse der Heteromerisierung von hyperpolarisationsaktivierten und zyklisch Nukleotid-gesteuerten Ionenkanälen (HCN-Kanälen) |c Annuka Aho |
| 264 | 1 | |a [Bonn] |b Caesar [u.a.] |c 2010 | |
| 300 | |a XII, 156 S. |b Ill., graph. Darst. | ||
| 336 | |b txt |2 rdacontent | ||
| 337 | |b n |2 rdamedia | ||
| 338 | |b nc |2 rdacarrier | ||
| 502 | |a Zugl.: Köln, Univ., Diss., 2010 | ||
| 655 | 7 | |0 (DE-588)4113937-9 |a Hochschulschrift |2 gnd-content | |
| 856 | 4 | 2 | |m HBZ Datenaustausch |q application/pdf |u http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=020639651&sequence=000002&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA |3 Inhaltsverzeichnis |
| 999 | |a oai:aleph.bib-bvb.de:BVB01-020639651 | ||
Datensatz im Suchindex
| _version_ | 1804143370697703424 |
|---|---|
| adam_text | Titel: Analyse der Heteromerisierung von hyperpolarisationsaktivierten und zyklisch Nukleotid-gesteuerten I
Autor: Aho, Annukka Mirjami
Jahr: 2010
I Inhaltsverzeichnis
I Inhaltsverzeichnis
i inhaltsverzeichnis.............................................................................................................i
ii abkürzungsverzeichnis..................................................................................................v
1 Einleitung.............................................................................................................................1
1.1 HCN-Kanäle: Eigenschaften......................................................................................................................1
1.2 HCN-Kanäle: Expression...........................................................................................................................6
1.3 HCN-Kanäle: Funktion..............................................................................................................................8
1.3.1 Generierung / Modulation spontaner rhythmischer Aktivität im Gehirn..............................................9
1.3.2 Modulation der Kabeleigenschaften eines Neurons............................................................................11
1.3.3 Regulation der synaptischen Transmission.........................................................................................12
1.3.4 HCN knock-out Mausmodelle.............................................................................................................13
1.4 Zielsetzung der Arbeit..............................................................................................................................15
2 Material und Methoden.................................................................................................17
2.1 Material.....................................................................................................................................................17
2.2 E.coli Zellkultur.......................................................................................................................................18
2.2.1 Verwendete Bakterienstämme und Plasmidvektoren..........................................................................18
2.2.2 Zusammensetzung und Herstellung der Kulturmedien für E. coli......................................................19
2.2.3 Anzucht von E. coli Bakterienkulturen...............................................................................................20
2.2.3.1 Anzucht von E. coli Zellen zur Plasmidpräparation....................................................................20
2.2.3.2 Herstellung kompetenter Zellen zur Transformation mit Plasmid-DNA....................................20
23 DNA-Präparationen.................................................................................................................................20
2.3.1 Präparation von genomischer DNA aus Mausgewebe........................................................................20
2.3.2 Plasmid-DNA-Präparationen..............................................................................................................21
2.3.2.1 Alkalische Mega-Präparation......................................................................................................21
2.3.2.2 Qiagen Plasmidpräparation.........................................................................................................22
2.4 Reinigung und Trennung von Nukleinsäuren........................................................................................22
2.4.1 Phenol/Chloroform-Extraktion...........................................................................................................22
2.4.2 Ethanol-Präzipitation..........................................................................................................................23
2.4.3 Quantifizierung von Nukleinsäuren....................................................................................................23
2.4.3.1 Photometrische Bestimmung der Nukleinsäurekonzentration.....................................................23
2.4.3.2 Konzentrationsbestimmung mit Hilfe von Agarosegelen............................................................24
2.4.4 Auftrennung von DNA in Agarosegelen.............................................................................................24
2.4.5 DNA-Größen- und Mengenstandards.................................................................................................25
2.5 Manipulation von Nukleinsäuren............................................................................................................25
2.5.1 Restriktion von Plasmid-DNA mit Restriktionsendonukleasen..........................................................25
2.5.2 Retransformation.................................................................................................................................26
2.6 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)..........................................................................................................26
I Inhaltsverzeichnis
2.7 Heterologe Genexpression in HEK293-Zellen........................................................................................27
2.7.1 Kulturbedingungen für HEK293-Zellen.............................................................................................27
2.7.2 Transiente Expression von Proteinen in HEK293-Zellen...................................................................29
2.7.2.1 Transfektion nach der CaP04-Methode.......................................................................................29
2.7.2.2 Transfektion mittels ?Lipofectamine LTX ................................................................................30
2.7.3 Stabile Expression von Proteinen in HEK293-Zellen.........................................................................31
2.8 Versuchstiere.............................................................................................................................................32
2.9 ZelI-/Gewebepräparationen.....................................................................................................................33
2.9.1 Zellernte adhärent wachsender HEK293-Zellen.................................................................................33
2.9.2 Präparation von Mausgewebe.............................................................................................................34
2.9.2.1 Präparation von Hirngewebe der Maus.......................................................................................34
2.9.2.2 Präparation anderer Organe der Maus.........................................................................................35
2.10 Präparation von Membranproteinen....................................................................................................35
2.10.1 Präparation von Membranproteinen aus HEK293-Zellen.................................................................35
2.10.2 Präparation von Membranproteinen aus Mausgewebe.....................................................................36
2.11 Quantifizierung von Proteinen..............................................................................................................37
2.11.1 Konzentrationsbestimmung nach Bradford( 1976)...........................................................................37
2.11.2 Konzentrationsbestimmung mit Amidoschwarz...............................................................................37
2.11.3 Konzentrationsbestimmung mit Bicinchoninsäure (BCA)................................................................38
2.12 Deglykosylierung von Membranproteinen...........................................................................................39
2.13 Trennung von Proteinen durch Gelelektrophorese.............................................................................39
2.13.1 Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)............................................39
2.13.2 Verwendete Protein-Größenstandards..............................................................................................40
2.13.3 Bestimmung der Molekülmasse mittels SDS-PAGE........................................................................42
2.13.4 Färben von SDS-Polyacrylamid-Gelen mit Coomassie-Lösung.......................................................42
2.14 Nachweis spezifischer Proteine..............................................................................................................43
2.14.1 Transfer und Immobilisierung von Proteinen (?Western-Blot ).......................................................43
2.14.2 Immunologischer Nachweis von immobilisierten Proteinen............................................................43
2.14.3 Entfernung von primären und sekundären Antikörpern (?Strippen )...............................................45
2.14.4 Densitometrisehe Auswertung (?AIDA Image Analyzer )...............................................................46
2.14.5 Amidoschwarz-Färbung der Membran.............................................................................................46
2.15 Immunfluoreszenz..................................................................................................................................47
2.15.1 Immunzytochemische Färbung von HEK293-Zellen........................................................................47
2.15.2 Immunhistochemische Färbungen....................................................................................................49
2.15.2.1 Perfusion...................................................................................................................................49
2.15.2.2 Anfertigen von Gefrierschnitten................................................................................................50
2.15.2.3 Immunhistochemische Färbungen von Gefrierschnitten...........................................................50
2.15.3 Ko-Lokalisationsanalyse...................................................................................................................51
2.16 Verwendete Antikörper..........................................................................................................................52
2.16.1 Erstantikörper....................................................................................................................................52
2.16.2 Aufreinigung von polyklonalen Antiseren über Peptidsäulen...........................................................53
2.16.3 Zweitantikörper.................................................................................................................................54
2.17 Affinitätschromatographie an einer Antikörper-Säulenmatrix.........................................................55
2.17.1 Immobilisierung von monoklonalen Antikörpern an Protein G-Sepharose......................................55
2.17.2 Ko-Immunpräzipitation.....................................................................................................................56
2.17.3 Bestimmung der Ausbeute einer Ko-Immunpräzipitation................................................................57
2.18 Elektrophysiologische Untersuchung der heterolog exprimierten HCN-Kanäle..............................57
I Inhaltsverzeichnis III
3 Ergebnisse...........................................................................................................................59
3.1 Solubilisierung von HCN-Kanalproteinen.............................................................................................59
3.2 Nachweis von HCN-Kanälen in HEK293-Zellen und in Hirngeweben der Maus...............................63
3.2.1 Expression und Glykosylierung von HCN-Kanälen in HEK293-Zellen.............................................63
3.2.1.1 Immunzytochemische und biochemische Charakterisierung der stabilen rHCN-Linien.............63
3.2.1.2. Glykosylierung von HCN-Kanälen in HEK293-Zellen.............................................................68
3.2.2 Expression und Glykosylierung von nativen HCN-Kanälen im Gehirn der Maus.............................73
3.3 Funktionelle Expression von HCN3 in HEK293-Zellen........................................................................81
3.3.1 Expression von heterolog exprimiertem HCN3-Protein in der Plasmamembran................................81
3.3.2 Charakterisierung der doppeltstabilen HEK293-Linien rHCNl/3 und rHCNl/3HA..........................86
3.4 Elektrophysiologische Charakterisierung heterolog exprimierter HCN-Kanäle................................91
3.5 Ko-Immunpräzipitation von heterolog exprimierten HCN-Kanälen..................................................96
3.6 Ko-Immunpräzipitation von nativen HCN-Kanälen aus Hirngeweben der Maus...........................100
3.6.1 Ergebnisse.........................................................................................................................................100
3.6.2 Zusammenfassung.............................................................................................................................118
4 Diskussion.........................................................................................................................121
4.1 Heteromere HCN-Kanäle.......................................................................................................................122
4.1.1 Heteromere HCN-Kanäle im heterologen Expressionssystem..........................................................122
4.1.2 Heteromere HCN-Kanäle im Gehirn................................................................................................123
4.1.3 Mögliche Ursachen der geringen Ausbeuten bei Ko-Immunpräzipitationen mit nativem Gewebe.. 124
4.2 Bindeproteine und zusätzliche Untereinheiten (auxiliary subunits)...................................................125
4 J Ausblick I: Weitere Untersuchungen an heteromeren HCN-Kanäle.................................................128
4.3.1 Untersuchung der Plasmamembranexpression mittels unroofing.....................................................128
4.3.2 Bestimmung der Stöchiometrie von HCN-Kanälen: FRET + TIRF.................................................131
4.4 Ausblick II: Bedeutung und Funktion heteromerer HCN-Kanäle.....................................................133
5 LITERATURVERZEICHNIS....................................................................................................135
6 ANHANG...............................................................................................................................147
6.1 Ergebnisse zur Expression der vier HCN-Isoformen im Gehirn........................................................147
6.2 Aminosäuresequenzvergleich der mHCN-Isoformen..........................................................................148
6.3 In dieser Arbeit verwendete Plasmide..................................................................................................151
6.4 In dieser Arbeit verwendete Primer......................................................................................................152
6.5 HCN-Antikörper und die Lokalisation der jeweiligen Antigene........................................................152
6.6 Qualitative Beschreibung der Ko-Immunpräzipitationen von nativen HCN-Kanälen....................153
6.7 Übersicht über die Quantifizierung der Ko-Immunpräzipitationen..................................................154
6.7.1 Ausbeuten vor der Normalisierung...................................................................................................154
6.7.2 Ausbeuten nach der Normalisierung.................................................................................................155
6.8 Immunhistochemisch nachgewiesene Kombinationen von HCN-Heteromeren................................156
|
| any_adam_object | 1 |
| author | Aho, Annukka |
| author_facet | Aho, Annukka |
| author_role | aut |
| author_sort | Aho, Annukka |
| author_variant | a a aa |
| building | Verbundindex |
| bvnumber | BV036721788 |
| ctrlnum | (OCoLC)705906254 (DE-599)HBZHT016419244 |
| format | Thesis Book |
| fullrecord | <?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?><collection xmlns="http://www.loc.gov/MARC21/slim"><record><leader>01156nam a2200289 c 4500</leader><controlfield tag="001">BV036721788</controlfield><controlfield tag="003">DE-604</controlfield><controlfield tag="005">20110413 </controlfield><controlfield tag="007">t</controlfield><controlfield tag="008">101015s2010 ad|| m||| 00||| ger d</controlfield><datafield tag="035" ind1=" " ind2=" "><subfield code="a">(OCoLC)705906254</subfield></datafield><datafield tag="035" ind1=" " ind2=" "><subfield code="a">(DE-599)HBZHT016419244</subfield></datafield><datafield tag="040" ind1=" " ind2=" "><subfield code="a">DE-604</subfield><subfield code="b">ger</subfield><subfield code="e">rakwb</subfield></datafield><datafield tag="041" ind1="0" ind2=" "><subfield code="a">ger</subfield></datafield><datafield tag="049" ind1=" " ind2=" "><subfield code="a">DE-355</subfield><subfield code="a">DE-188</subfield><subfield code="a">DE-83</subfield></datafield><datafield tag="088" ind1=" " ind2=" "><subfield code="a">Caesar 00004</subfield></datafield><datafield tag="100" ind1="1" ind2=" "><subfield code="a">Aho, Annukka</subfield><subfield code="e">Verfasser</subfield><subfield code="4">aut</subfield></datafield><datafield tag="245" ind1="1" ind2="0"><subfield code="a">Analyse der Heteromerisierung von hyperpolarisationsaktivierten und zyklisch Nukleotid-gesteuerten Ionenkanälen (HCN-Kanälen)</subfield><subfield code="c">Annuka Aho</subfield></datafield><datafield tag="264" ind1=" " ind2="1"><subfield code="a">[Bonn]</subfield><subfield code="b">Caesar [u.a.]</subfield><subfield code="c">2010</subfield></datafield><datafield tag="300" ind1=" " ind2=" "><subfield code="a">XII, 156 S.</subfield><subfield code="b">Ill., graph. Darst.</subfield></datafield><datafield tag="336" ind1=" " ind2=" "><subfield code="b">txt</subfield><subfield code="2">rdacontent</subfield></datafield><datafield tag="337" ind1=" " ind2=" "><subfield code="b">n</subfield><subfield code="2">rdamedia</subfield></datafield><datafield tag="338" ind1=" " ind2=" "><subfield code="b">nc</subfield><subfield code="2">rdacarrier</subfield></datafield><datafield tag="502" ind1=" " ind2=" "><subfield code="a">Zugl.: Köln, Univ., Diss., 2010</subfield></datafield><datafield tag="655" ind1=" " ind2="7"><subfield code="0">(DE-588)4113937-9</subfield><subfield code="a">Hochschulschrift</subfield><subfield code="2">gnd-content</subfield></datafield><datafield tag="856" ind1="4" ind2="2"><subfield code="m">HBZ Datenaustausch</subfield><subfield code="q">application/pdf</subfield><subfield code="u">http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=020639651&sequence=000002&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA</subfield><subfield code="3">Inhaltsverzeichnis</subfield></datafield><datafield tag="999" ind1=" " ind2=" "><subfield code="a">oai:aleph.bib-bvb.de:BVB01-020639651</subfield></datafield></record></collection> |
| genre | (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content |
| genre_facet | Hochschulschrift |
| id | DE-604.BV036721788 |
| illustrated | Illustrated |
| indexdate | 2024-07-09T22:46:35Z |
| institution | BVB |
| language | German |
| oai_aleph_id | oai:aleph.bib-bvb.de:BVB01-020639651 |
| oclc_num | 705906254 |
| open_access_boolean | |
| owner | DE-355 DE-BY-UBR DE-188 DE-83 |
| owner_facet | DE-355 DE-BY-UBR DE-188 DE-83 |
| physical | XII, 156 S. Ill., graph. Darst. |
| publishDate | 2010 |
| publishDateSearch | 2010 |
| publishDateSort | 2010 |
| publisher | Caesar [u.a.] |
| record_format | marc |
| spelling | Aho, Annukka Verfasser aut Analyse der Heteromerisierung von hyperpolarisationsaktivierten und zyklisch Nukleotid-gesteuerten Ionenkanälen (HCN-Kanälen) Annuka Aho [Bonn] Caesar [u.a.] 2010 XII, 156 S. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Zugl.: Köln, Univ., Diss., 2010 (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content HBZ Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=020639651&sequence=000002&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
| spellingShingle | Aho, Annukka Analyse der Heteromerisierung von hyperpolarisationsaktivierten und zyklisch Nukleotid-gesteuerten Ionenkanälen (HCN-Kanälen) |
| subject_GND | (DE-588)4113937-9 |
| title | Analyse der Heteromerisierung von hyperpolarisationsaktivierten und zyklisch Nukleotid-gesteuerten Ionenkanälen (HCN-Kanälen) |
| title_auth | Analyse der Heteromerisierung von hyperpolarisationsaktivierten und zyklisch Nukleotid-gesteuerten Ionenkanälen (HCN-Kanälen) |
| title_exact_search | Analyse der Heteromerisierung von hyperpolarisationsaktivierten und zyklisch Nukleotid-gesteuerten Ionenkanälen (HCN-Kanälen) |
| title_full | Analyse der Heteromerisierung von hyperpolarisationsaktivierten und zyklisch Nukleotid-gesteuerten Ionenkanälen (HCN-Kanälen) Annuka Aho |
| title_fullStr | Analyse der Heteromerisierung von hyperpolarisationsaktivierten und zyklisch Nukleotid-gesteuerten Ionenkanälen (HCN-Kanälen) Annuka Aho |
| title_full_unstemmed | Analyse der Heteromerisierung von hyperpolarisationsaktivierten und zyklisch Nukleotid-gesteuerten Ionenkanälen (HCN-Kanälen) Annuka Aho |
| title_short | Analyse der Heteromerisierung von hyperpolarisationsaktivierten und zyklisch Nukleotid-gesteuerten Ionenkanälen (HCN-Kanälen) |
| title_sort | analyse der heteromerisierung von hyperpolarisationsaktivierten und zyklisch nukleotid gesteuerten ionenkanalen hcn kanalen |
| topic_facet | Hochschulschrift |
| url | http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=020639651&sequence=000002&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA |
| work_keys_str_mv | AT ahoannukka analysederheteromerisierungvonhyperpolarisationsaktiviertenundzyklischnukleotidgesteuertenionenkanalenhcnkanalen |