Molekulare Mechanismen der cGMP-cAMP-vermittelten Relaxation des murinen Fundus:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2009
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INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
I
I
EINLEITUNG
1
1
FUNKTION
DES
GASTROINTESTINALTRAKTS
1
2
DER
MAGEN
1
2.1
AUFBAU
UND
FUNKTION
DES
MAGENS
1
2.2
REFLEKTORISCHE
REGULATION
DER
MAGEN-(DARM)-MOTORIK
3
3
DAS
ENTERISCHE
NERVENSYSTEM
3
3.1
AUFBAU
DES
ENTERISCHEN
NERVENSYSTEMS
3
3.2
FUNKTION
DES
ENTERISCHEN
NERVENSYSTEMS
-
ROLLE
DER
NANC-NEURONE
4
3.3
ROLLE
DES
NO
UND
DER
PEPTIDTRANSMITTER
BEI
DER
GASTROINTESTINALEN
RELAXATION
4
4
DIE
GLATTE
MUSKULATUR
7
4.1
MORPHOLOGISCHE
CHARAKTERISTIKA
7
4.2
AUFBAU
DER
MYOFILAMENTE
8
4.2.1
DIE
DUENNEN
FILAMENTE
8
4.2.2
DIE
DICKEN
FILAMENTE
9
4.2.3
DIE
INTERMEDIAERFILAMENTE
10
4.3
MOLEKULARER
MECHANISMUS
DER
KONTRAKTION
UND
RELAXATION
11
5
ZENTRALE
ROLLE
DES
CA
2+
BEI
KOPPLUNG
VON
ERREGUNG
UND
KONTRAKTION
12
5.1
MECHANISMEN
ZUR
KOPPLUNG
VON
ERREGUNG
UND
KONTRAKTION
12
5.1.1
ELEKTROMECHANISCHE
KOPPLUNG
12
5.1.2
PHARMAKOMECHANISCHE
KOPPLUNG
12
6
REGULATORISCHE
SCHLUESSELPROTEINE
DER
KONTRAKTION
UND
RELAXATION:
MLCK
UND
MLCP
14
6.1
MLCK
UND
MLCP
BESTIMMEN
DEN
TONUS
UEBER
MLC20-PHOSPHORYLIERUNG
14
6.2
MYOSIN
LEICHTE
KETTEN-KINASE
(MLCK)
14
6.2.1
ISOFORMEN
DER
GLATTMUSKULAEREN
MLCK
15
6.2.1.1
DIE
KURZE
GLATTMUSKULAERE
ISOFORM
15
6.2.1.2
DIE
LANGE
GLATTMUSKULAERE
ISOFORM
15
6.2.1.3
TELOKIN
16
6.2.2
DAS
KATALYTISCHE
ZENTRUM
DER
MLCK
16
6.3
MYOSIN
LEICHTE
KETTEN-PHOSPHATASE
(MLCP)
17
7
MODULATION
DER
CA
2+
-SENSITIVITAET
DER
MYOFILAMENTE
18
7.1
CA2-SENSITIVIERUNG
UND
-DESENSITIVIERUNG
UEBER
REGULATION
DER
BEZIEHUNG
ZWISCHEN
CA
2+
-
KONZENTRATION
UND
M
LC20-PHOSPHORY
1
IERUNG
19
7.1.1
MODULATION
DER
MLCK-AKTIVITAET
20
7.1.2
MODULATION
DER
MLCP-AKTIVITAET
21
7.1.3
ROLLE
VON
CA?--UNABHAENGIGEN
KINASEN
BEI
DER
AUFRECHTERHALTUNG
DER
TONISCHEN
KONTRAKTION
23
7.2
CA2*-SENSITIVIERUNG
UND
-DESENSITIVIERUNG
UEBER
REGULATION
DER
BEZIEHUNG
ZWISCHEN
MLCIO-PHOSPHORYLIERUNG
UND
KONTRAKTIONSKRAFT
24
8
BETEILIGUNG
VON
CALDESMON
AN
DER
TONUSREGULATION
DER
GLATTEN
MUSKULATUR
25
9
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
28
II
MATERIAL
UND
METHODEN
31
1
MATERIAL
31
1.1
CHEMIKALIEN
UND
ENZYME
31
1.2
AGONISTEN
UND
INHIBITOREN
31
1.3
ZELLKULTURWARE,
MEDIEN
UND
ZUSAETZE
31
1.4
MOLEKULARGEWICHTSMARKER
32
1.5
PRIMAERANTIKOERPER
32
1.6
SEKUNDAERANTIKOERPER
33
1.7
VEKTOREN/PLASMIDE
33
1.8
OLIGONUKLEOTIDE
33
1.9
KITS
34
1.10
GERAETE
34
2
GEWEBEPRAEPARATION
UND
HISTOLOGIE
DER
FUNDUSSTREIFEN
36
2.1
HERKUNFT
DER
GEWEBE
36
2.2
HERSTELLUNG
DER
LOESUNGEN
36
2.3
PRAEPARATION
GLATTMUSKULAERER
GEWEBE
37
2.3.1
PRAEPARATION
VOM
FUNDUS
37
2.3.2
PRAEPARATION
DER
LAENGSMUSKULATUR
DES
ILEUMS
38
2.3.3
PRAEPARATION
DER
MAUSSCHWANZARTERIE
38
2.4
HISTOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
FUNDUSPRAEPARATE
39
3
PHYSIOLOGISCHE
MESSUNGEN
DER
FUNDUSPRAEPARATE
40
3.1
AUFBAU
UND
FUNKTIONSWEISE
DER
YYAPPARATUR ZUR
KRAFTMESSUNG
UND
KRYOKONSERVIERUNG
"
40
3.2
AUFBAU
UND
FUNKTIONSWEISE
DER
YYAPPARATUR
ZUR
KRAFT
UND
CALCIUMMESSUNG
"
42
3.2.1
FURA-2
AM
ALS
INDIKATOR
DER
FREIEN,
INTRAZELLULAEREN
CA
2
-KONZENTRATION
44
3.3
EXPERIMENTELLE
PROTOKOLLE
46
3.3.1
STANDARD-VERSUCHSPROTOKOLL
FUER
KRAFTMESSUNGEN
46
3.3.2
KALIBRIERUNGSPROTOKOLL
ZUR
MESSUNG
DES
INTRAZELLULAEREN
CALCIUMS
47
4
BIOCHEMISCHE
METHODEN
ZUR
PROTEINCHARAKTERISIERUNG
47
4.1
TCA
/
ACETON-FIXIERUNG
DER
SCHOCKGEFRORENEN
MUSKELPRAEPARATE
47
4.2
HOMOGENISIERUNG
DER
TCA
/
ACETON-FIXIERTEN
GLATTMUSKULAEREN
PRAEPARATE
48
4.3
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
48
4.4
ZWEIDIMENSIONALE
GELELEKTROPHORESE
(2D-GELELEKTROPHORESE)
49
4.4.1
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
(IEF)
49
4.4.2
SDS-GELELEKTROPHORESE
(2.
DIMENSION)
50
4.5
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
IN
POLYACRYLAMIDGELEN
UND
FAERBETECHNIKEN
50
4.5.1
PROTEINFAERBUNG
COOMASSIE
BRILLIANTBLUE
R-250
IN
POLYACRYLAMIDGELEN
50
4.5.2
SILBERFAERBUNG
VON
PROTEINEN
IN
POLYACRYLAMIDGELEN
51
4.5.3
SYPRO
RUBY-FAERBUNG
VON
PROTEINEN
IN
POLYACRYLAMIDGELEN
51
4.6 BESTIMMUNG
VON
PROTEINKONZENTRATIONEN
NACH
BRADFORD
(BRADFORD,
1976)
51
4.7
IMMUNOLOGISCHE
VERFAHREN
52
4.7.1
WESTERN
BLOT-ANALYSE
UND
SPEZIFISCHER
ANTIKOERPERNACHWEIS
VON
PROTEINEN
52
4.7.2
STRIPPING
VON
NITROCELLULOSEMEMBRANEN
53
4.8
A-PTHR
18
ANTIKOERPERTESTUNG
MITTELS
ELISA
53
4.9
RHO-PULLDOWN
ASSAY
54
4.10 MASSENSPEKTROMETRIE
(MALDI-TOF-MS
/
LC-MS/MS)
55
5
MIKROBIOLOGISCHE
METHODEN
55
5.1
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI-STAEMMEN
55
5.2
KULTIVIERUNG
VON
BAKTERIEN
UND
BAC-KLONEN
IN
UEBERNACHTKULTUREN
56
5.3
REKOMBINATION
ZWISCHEN
BAC-DNA
UND
PL451
IN
EL250-ZELLEN
56
6
GENETISCHE
METHODEN
57
6.1
ISOLIERUNG
UND
AUFREINIGUNG
VON
PLASMID-DNA
57
6.2
ISOLIERUNG
UND
AUFREINIGUNG GENOMISCHER
MAUSSCHWANZ-DNA
57
6.3
ISOLIERUNG
UND
AUFREINIGUNG
VON
GESAMT-RNA
57
6.4
ALLGEMEINE
GENETISCHE
METHODEN
57
6.4.1
BESTIMMUNG
DER
KONZENTRATION
UND
REINHEIT
VON
NUKLEINSAEUREN
57
6.4.2
RESTRIKTIONSHYDROLYSE
VON
DNA
58
6.4.3
PHENOL-CHLOROFORM-AUFREINIGUNG
UND
ENTSALZEN
VON
PLASMID-DNA
58
6.4.4
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
58
6.4.5
GELELUTION
UND
AUFFEINIGUNG
VON
PCR-AMPLIFIKATEN
UND
DNA-FRAGMENTEN
59
6.4.6
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
FREIEN
DNA-ENDEN
MIT
ALKALISCHER
PHOSPHATASE
59
6.4.7
UMWANDLUNG
VON
UEBERHAENGENDEN
5
'-ENDEN
IN
STUMPFE
ENDEN
(YYBLUNTING")
59
6.4.8
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
59
6.5
DNA-AMPLIFIZIERUNG
DURCH
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
60
6.5.1
QUANTITATIVE
REAL-TIME-PCR
61
6.5.2
OLIGONUKLEOTIDPRIMER
UND
-SONDEN
62
7
METHODEN
ZUR
KULTIVIERUNG
UND
GENOTYPISCHER
ANALYSE
VON
ES-ZELLEN
62
7.1
KULTIVIERUNG
VON
SELEKTION
VON
ES-ZELLEN
62
7.2
PRAEPARATION
VON
GENOMISCHER
DNA
AUS
ES-ZELLEN
64
8
STATISTIK
64
III
ERGEBNISSE
65
1
HISTOLOGISCHE
UNTERSUCHUNG
DER
FUNDUSSTREIFEN
65
2
ENTWICKLUNG
DES
VERSUCHSPROTOKOLLS
65
2.1
LAENGEN-SPANNUNGSDIAGRAMME
65
2.2
AUFNAHME
VON
DOSISWIRKUNGSKURVEN
67
2.2.1
DOSISWIRKUNGSKURVE
MIT
CARBACHOL
68
2.2.2
DOSISWIRKUNGSKURVE
MIT
FORSKOLIN
69
2.3
FURA-2
HAT
KEINEN
EINFLUSS
AUF
DIE
KRAFTENTWICKLUNG
DER
FUNDUSPRAEPARATE
70
2.4
RELAXATION
DER
FUNDUSPRAEPARATE
MITTELS
ELEKTRISCHER
FELDSTIMULATION
71
2.4.1
BESTIMMUNG
DER
OPTIMALEN
EFS-PULSDAUER
71
2.4.2
BESTIMMUNG
DER
OPTIMALEN
EFS-FREQUENZ
72
2.4.3
BESTIMMUNG
DER
ZEITPUNKTE
ZUR
UNTERSUCHUNG
DER
PHOSPHORYLIERUNG
DER
MYPT1,
CPI-17
UND
TELOKIN
SOWIE
DER
MLC20
73
3
DIE
INTRAZELLULAERE
CA2*-KONZENTRATION
ALS
INDIKATOR
FUER
DIE
MLCK-AKTIVITAET
74
4
REGULATION
DER
MLCP-AKTIVITAET
76
4.1
MYPT1
-PHOSPHORYLIERUNG
AN
SER695,
THR696
UND
THR853
76
4.2
CPI-17
ALS
INHIBITOR
DER
MLCP
78
4.3
BESTIMMUNG
DER
RHOA-AKTIVITAET
79
4.4
TELOKIN
ALS
POTENZIELLER
AKTIVATOR
DER
MLCP
80
4.4.1
QUANTIFIZIERUNG
DER
TELOKIN-PHOSPHORYLIERUNG
AN
SERL3
80
4.4.2
PHYSIOLOGISCHE
ROLLE
VON
TELOKIN
IM
MURINEN
FUNDUS
81
5
CHARAKTERISIERUNG
DER
MLC20-PHOSPHORYLIER
UNG
83
5.1
UNTERSUCHUNG
DER
MLC20-PHOSPHORYLIERUNG
MITTELS
2D-GELELEKTROPHORESE
83
5.2
MALDI-TOF
UND
LC-MS/MS-UNTERSUCHUNGEN
86
5.3
QUANTIFIZIERUNG
DER
MLC20-PHOSPHORYLIERUNG
AN
SERI
9
BZW.
THRL8
89
5.3.1
UEBERPRUEFUNG
DER
SPEZIFITAET
DES
VERWENDETEN
A-PTHRL
8-ANTIKOERPERS
90
6
EINFLUSS
DES
REGULATORPROTEINS
CALDESMONS
92
6.1
PHYSIOLOGISCHE
ROLLE
DES
CALDESMON
BEI
DER
TONUSREGULATION
DES
FUNDUS
92
6.2
EXPRESSION
DES
TRUNKIERTEN
CALDESMONPROTEINS
UND
WEITERER
KONTRAKTILER
PROTEINE
94
6.2.1
EXPRESSION
VON
CALDESMON
AUF
MRNA-UND
PROTEINEBENE
94
6.2.2
EXPRESSION
ANDERER
KONTRAKTILER
PROTEINE
96
7
HERSTELLUNG
EINER
CALD
1(-/-)-MAUSLINIE
MITTELS
EINES
BAC-VEKTORS
96
7.1
GENERIERUNG
DES
YYPL451
-INTRON
1/13-VEKTORS"
97
7.2
HOMOLOGE
REKOMBINATION
ZWISCHEN
BAC-CALD1
UND
PL451
-INTRON
1/1
3-VEKTOR
99
7.3
DELETION
DES
CALDI-GENS
IN
MURINEN
ES-ZELLEN
DURCH
HOMOLOGE
REKOMBINATION
100
7.4
IDENTIFIKATION
VON
CALDL(+/-)-ES-ZELLKLONEN
101
7.5
ERZEUGUNG
VON
CALDL(+/-)-FOUNDERMAEUSEN
102
IV
DISKUSSION
103
1
ETABLIERUNG
DER
VERSUCHSSYSTEME
104
1.1
OPTIMIERUNG
DER
MYOGRAPHENMESSSYSTEME
104
1.1.1
HISTOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
FUNDUSPRAEPARATE
104
1.1.2
DAS
LAENGEN-SPANNUNGSDIAGRAMM
DES
MURINEN
FUNDUS
104
1.1.3
TEST
AUF
AKTIVIERBARKEIT
MITTELS
K
+
105
1.1.4
FUNKTIONALITAETSTEST
DER
FUNDUSPRAEPARATE
MITTELS
CARBACHOL
UND
FORSKOLIN
105
1.1.5
OPTIMIERUNG
DER
EFS-BEDINGUNGEN
105
1.1.5.1
INHIBITOREN
SOWIE
EINE
KURZE
PULSDAUER
ERMOEGLICHEN
DIE
AUSSCHLIESSLICHE
AKTIVIERUNG
DER
NANC-NEURONE
105
1.1.5.2
SIMULATION
DER
IN
VIVO-TRANSMITTERAUSSCHUETTUNG
DURCH
DIE
WAHL
DER
EFS-FREQUENZ
106
1.2
OPTIMIERUNG
DER
METHODE
ZUR
BESTIMMUNG
DES
INTRAZELLULAEREN
CALCIUMS
107
1.3
AUSWAHL
SPEZIFISCHER
PHOSPHOANTIKOERPER
107
2
SIGNALTRANSDUKTIONSWEGE
DER
ENDOTHELIN-1
-INDUZIERTEN
KONTRAKTION
108
2.1
DIE
CA2/CAM-ABHAENGIGE
MLCK
BLEIBT
AUF
DEM
TONISCHEN
ET
1
-KRAFTPLATEAU
AKTIV
108
2.2
DIE
MLCP
LIEGT
AUF
DEM
ET
1
-KRAFTPLATEAU
GEHEMMT
VOR
109
2.3
DER
INHIBITOR
DER
MLCP,
CPI-17,
WIRD
NICHT
AKTIVIERT
110
2.4
AKTIVIERUNG
VON
RHOA
FUHRT
ZUR
PHOSPHORYLIERUNG
VON
MYPT1
110
2.5
TELOKIN,
EIN
POTENZIELLER
AKTIVATOR
DER
MLCP,
WIRD
INHIBIERT
112
2.6
DIE
MLC20
WERDEN
AN
SER
19
ODERTHRL8
MONOPHOSPHORYLIERT
112
2.7
MODELL
ZUR
REGULATION
DER
ET
1
-INDUZIERTEN
KONTRAKTION
114
3
SIGNALWEGE
DER
EFS-INDUZIERTEN
RELAXATION
115
3.1
DIE
EFS-INDUZIERTE
RELAXATION
WIRD
UEBER
CGMP
UNDCAMP
AUSGELOEST
115
3.2
DIE
EFS-INDUZIERTE
RELAXATION
GEHT
MIT
EINER
ABNAHME
DER
MLCK-AKTIVITAET
EINHER
116
3.3
DER
EFS-INDUZIERTEN
RELAXATION
GEHT
EINE
AKTIVIERUNG
DER
MLCP
VORAUS
117
3.4
THR696
UND
THR853
WERDEN
TROTZ
AKTIVEM
RHOA
DEPHOSPHORYLIERT
118
3.5
ROLLE
DES
TELOKINS
119
3.6
DIE
MLC20-PHOSPHORYLIERUNG
AN
THRL8
STEIGT
TROTZ
ANHALTENDER
RELAXATION
WIEDER
AN
120
3.7
MODELL
ZUR
REGULATION
DER
EFS-INDUZIERTEN
RELAXATION
121
4
ROLLE
VON
CALDESMON
BEI
DER
TONUSREGULATION
DES
MURINEN
FUNDUS
122
4.1
AUSWIRKUNGEN
EINER
DELETION
DER
HOCHAFFINEN
MYOSINBINDESTELLE
122
4.2
GENERIERUNG
EINER
MAUSLINIE
MIT
TOTALER
ABLATION
DES
CALDESMON-GENS
124
V
LITERATURVERZEICHNIS
127
VIANHANG
145
1
EIGENSTAENDIGKEITSERKLAERUNG
145
2
LEBENSLAUF
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