Identifikation und Analyse großer Mutationen im BRCA1-Gen mittels MLPA bei Patientinnen mit Verdacht auf hereditäres Mamma- und, oder Ovarialkarzinom:
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2009
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| adam_text | Titel: Identifikation und Analyse großer Mutationen im BRCA1-Gen mittels MLPA bei Patientinnen mit Verdach
Autor: Mierzejewski, Marek
Jahr: 2009
Inhaltsverzeichnis
Danksagung.....................................................................................2
Abbildungsverzeichnis.....................................................................7
Tabellenverzeichnis.........................................................................9
Abkürzungen..................................................................................11
1 Einleitung.................................................................................^
1.1 Mammakarzinom................................................................................12
1.2 Ovarialkarzinom.................................................................................13
1.3 Krankheitsrelevanz von komplexen Mutationen.................................14
1.4 Hereditäres Mamma- und Ovarialkarzinom........................................15
1.5 Das BRCA1-Gen................................................................................20
1.5.1 Das BRCA1-Protein........................................................................21
1.5.2 Funktion..........................................................................................21
1.5.2.1 DNA-Reparatur........................................................................22
1.5.2.2 Zellzykluskontrolle...................................................................22
1.5.2.3 Remodellierung von Chromatin...............................................23
1.5.2.4 Ubiquitinylierung......................................................................23
1.5.3 Mutationsspektrum im BRCAf-Gen................................................24
1.5.3.1 Große Deletionen und Duplikationen.......................................25
1.6 Identifizierung von großen Mutationen...............................................27
2 Zielstellung..............................................................................29
3 Material und Methoden............................................................30
3.1 Material..............................................................................................30
3.1.1 Patientenkollektiv und Blutproben...................................................30
3.1.2 Gewebeproben...............................................................................30
3.1.3 Technische Geräte und Hilfsmittel (Tab. 3.1)..................................31
3.1.4 Allgemeine Reagenzien, Puffer, Stammlösungen (Tab. 3.2)..........32
3.1.5 Standards und Farbstoffe (Tab. 3.3)...............................................33
3.1.6 Enzyme (Tab. 3.4)..........................................................................34
3.1.7 Kommerzielle Kits (Tab. 3.5)...........................................................34
3.1.8 RT-PCR-Primer..............................................................................35
3.1.9 Long-Range-PCR-Primer................................................................36
3.1.10 Mikrosatelliten-Primer.................................................................36
3.2 Methoden...........................................................................................38
3.2.1 Erhebung der klinischen Daten.......................................................38
3.2.2 Isolierung genomischer DNA aus Vollblut.......................................38
3
3.2.3 Isolierung genomischer DNA aus Gewebe.....................................39
3.2.4 Konzentrationsbestimmung der DNA..............................................40
3.2.5 Template-Herstellung.....................................................................40
3.2.6 Isolierung von mRNA aus Vollblut..................................................41
3.2.7 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)..................................................42
3.2.8 Long-Range-Polymerase-Kettenreaktion(LR-PCR).......................43
3.2.8.1 Prinzip......................................................................................43
3.2.8.2 Long-Range-PCR Ansatz........................................................43
3.2.8.3 Long-Range-PCR Ablauf.........................................................44
3.2.9 Reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR)..........................................45
3.2.9.1 Prinzip......................................................................................45
3.2.9.2 RT-PCR Ansatz.......................................................................45
3.2.9.3 RT-PCR Ablauf........................................................................46
3.2.10 Sequenzierung............................................................................46
3.2.10.1 Prinzip..................................................................................46
3.2.10.2 Reinigung der PCR-Produkte...............................................47
3.2.10.3 Sequenzieransatz................................................................47
3.2.10.4 Sequenzierreaktion..............................................................48
3.2.10.5 Ethanolfällung des Sequenzierproduktes.............................48
3.2.10.6 Polyacrylamidgelelektrophorese und Sequenzierablauf.......49
3.2.11 Fragmentanalyse und Signalintensitätsmessung........................50
3.2.11.1 Agarosegelelektrophorese...................................................50
3.2.11.2 Polyacrylamid-Gelelektrophorese(PAGE)...........................51
3.2.11.3 Kapillargelelektrophorese.....................................................53
3.2.11.4 Signalintensitätsmessung....................................................53
3.2.12 MLPA..........................................................................................54
3.2.12.1 Prinzip..................................................................................54
3.2.12.2 Sonden.................................................................................55
3.2.12.3 Hybridisierung und Ligation..................................................57
3.2.12.4 MLPA-PCR..........................................................................58
3.2.12.5 Fragmentanalyse und Signalintensitätsmessung.................59
3.2.12.6 Datenanalyse.......................................................................59
3.2.13 Mikrosatelliten-Analyse...............................................................60
3.2.13.1 Prinzip des Deletionsnachweises.........................................61
3.2.13.2 Prinzip der LOH-Analyse......................................................62
3.2.13.3 Mikrosatelliten-PCR Ansatz.................................................62
3.2.13.4 Mikrosatelliten-PCR Ablauf..................................................62
3.2.14 Identitätstest................................................................................63
3.2.14.1 PCR und PAGE...................................................................63
4 Ergebnisse...............................................................................65
4.1 Auswertung des untersuchten Patientenkollektivs.............................65
4.2 Quantität und Qualität der isolierten DNA..........................................70
4.3 MLPA Durchführung...........................................................................71
4.4 Deletion von BRCA1 Exon 5 bis 14....................................................73
4.4.1 MLPA..............................................................................................73
4.4.1.1 Elektrophoresebild...................................................................73
4.4.1.2 Datenanalyse...........................................................................73
4.4.2 RT-PCR..........................................................................................75
4.4.3 Mi/crosate/lten-Analyse...................................................................78
4.5 Deletion des kompletten BRCA J-Gens..............................................79
4.5.1 MLPA..............................................................................................79
4.5.1.1 Elektrophoresebild...................................................................79
4.5.1.2 Datenanalyse...........................................................................80
4.5.2 Famih enuntersuctiung....................................................................81
4.5.2.1 Elektrophoresebild...................................................................81
4.5.2.2 Datenanalyse...........................................................................82
4.5.3 Mikrosatelliten-Analyse...................................................................83
4.6 Triplett-DeletioninßRCA1Exon17......... 85
4.6.1 MLPA....................................................................... s5
4.6.1.1 Elektrophoresebild...................................................................85
4.6.1.2 Datenanalyse.................................................. 86
4.6.2 Long-Range-PCR...................................... . . . ........... .«7
4.6.3 Sequenzanalyse........................... 88
4.6.4 LOH-Anafyse....................!ZZZZ...........................................88
4.7 Artefakte..................................... ..................................................g0
4.7.1 Multiplikation von BRCA1 Exon 8 ..........................................90
4.7.1.1 MLPA............................................. ...............................90
4.7.1.2 Wiederholung der MLPA-Analyse 92
4.7.1.3 RT-PCR........................................ZZ!Z!..........................93
5 Diskussion........................... Q.
5.1 Patientenkollektiv......................._,_..........................................g4
5.2 Komplexe SRCAI-MutattonenZ . . . ......................................95
5.2.1 Inzidenz....... ..............................................??
...............................,.......... 95
5.2.2 Anteil an allen BRCAf-Mutationen...... ................................96
5.2.3 MutationspeWrum................... ................................q7
5.2.3.1 Deletion von BRCA1 Exon 5 bis U.........................................98
5.2.3.2 Deletion des kompletten BRCA7-Gens ............................100
5.3 Genotyp-Phänotyp-Korrelation..........................ZZZ .......! Zl01
5
5.4 Triplett-Deletion in BRCA1 Exon 17.................................................104
5.5 Artefakte...........................................................................................107
5.5.1 Multiplikation von BRCA1 Exon 8..........................................107
5.6 MLPA als diagnostische Methode....................................................109
5.6.1 Bedeutung für die Diagnostik bei Verdacht auf hereditäres Mamma-
und/oderOvarialkarzinom.....................Fehlerl Textmarke nichtdefiniert
6 Zusammenfassung................................................................113
7 Literaturverzeichnis................................................................116
8 Lebenslauf.............................................................................728
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