Untersuchung subzellulärer Signaltransduktionswege in humanen Spermatozoen und deren Nutzung zur Entwicklung neuer Separationssysteme:
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Aachen
Shaker
2009
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1 EINLEITUNG.................................................................................................1
2 SPEZIELLE EINFÜHRUNG IN DIE THEMATIK............................................2
2.1 Biologische Besonderheiten von
Spermatozoon
..................................................2
2.1.1 Morphologie humaner Spermatozoen........................................................................2
2.1.2 Nukleares
Remodeling
...............................................................................................^
2.1.3 Transkription und Translation.....................................................................................5
2.1.4 Proteinbiochemische Besonderheiten humaner Spermatozoen................................5
2.2 Kapazitäten und Akrosomenreaktion humaner Spermien....................■......■......6
2.2.1
Second
messenger der Kapazitation:
Calcium
und cAMP.........................................7
2.2.2 Kapazitationsassoziierte Reorganisation der Spermien-Plasmamembran.................8
2.2.3 Aktivierung von
Proteinkînasen
und Proteinphosphorylierungen...............................9
2.2.4 Einfluss reaktiver Sauerstoffspezies auf den Kapazitationsprozess........................11
2.2.5 Calciurn-Calrnodulin-Systern....................................................................................12
2.2.6 Induktion von Kapazitation und Akrosomenreaktion in-vitro.....................................13
2.3 Apoptose-assoziierteSignaltransduktion............................................................14
2.3.1 Rezeptor-vermittelte extrinsische
(Тур
-l)
Apoptose.................................................
1ί>
2.3.2 Mitochondrial vermittelte intrinsische (Typ
II)
Apoptose...........................................16
2.3.3 ER-Stress vermittelte (Typ
III)
Apoptose..................................................................16
2.3.4 Proteasensysteme in der Apoptosesignaltransduktion.............................................17
2.3.5 Spaltung der
Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase
und DNA-Fragmentationen..............22
2.3.6 Apoptosesignaltransduktion in humanen Spermatozoen.........................................23
2.4 Potentielle Schnittstellen Kapazitations- und Apoptose-aesozilerter
Signaltransduktion in Spermatozoen...................................................................31
2.4.1 Calcium-abhängige Systeme: Calpain-Calpastatin und Calmodulin........................31
2.5 Separation humaner Spermatozoen.....................................................................32
2.5.1 Standardseparationstechniken zur Spermienaufbereitung vor einer künstlichen
Befruchtung.................................................. ...................32
2.5.2 Neue Ansätze zur Spermienseparation....................................................................37
2.6 Ziele der vorliegenden Arbelt im Detail.....................................................*1
XI
3 MATERIAL UND METHODEN....................................................................42
3.1 Probanden und Patienten......................................................................................42
3.2 Klassisches Spermiogramm.................................................................................42
3.3 Kryokonservierung................................................................................................43
3.4 Molekularbiologische Methoden...........................................................................44
3.4.1 Untersuchung der transkriptioneilen Aktivität maturer humaner Spermien..............44
3.4.2 RNA-Extraktion und Northern
Blot
...........................................................................45
3.4.3
Real-time
Polymerasekettenreaktion (PCR).............................................................46
3.4.4 Fluoreszenz-insitu-Hybridisierung
(FISH)
................................................................46
3.5 Proteinbiochemie (Westernblot)...........................................................................47
3.5.1 Proteinlysatpräparation............................................................................................47
3.5.2 SDS-Polyacrylamld-Gelelektrophorese....................................................................48
3.5.3 Proteintransfer und Immunoblot...............................................................................50
3.5.4 Detektionssystem: Chemilumeneszenztechnik........................................................51
3.6 Analyse von Signaltransduktionswegen..............................................................52
3.6.1 Induktion und Detektion der Kapazitäten.................................................................52
3.6.2 Induktion und Detektion der Akrosomenreaktion......................................................53
3.6.3 Inhibition von Calpain, Caspase-1 und Calmodulin..................................................54
3.6.4 Induktion verschiedener Apoptosesignalwege.........................................................55
3.6.5 Monitoring der Caspasenaktivierung........................................................................57
3.6.6 Bestimmung der Integrität des mitochondrialen Membranpotentials (MMP)............58
3.6.7 Monitoring der DNA-Fragmentation..........................................................................59
3.6.8 Nachweis der Externalisierung von Phosphatidylserin an der
Spermatozoon
membran...........................................................................................
60
3.7 Separationstechniken............................................................................................60
3.7.1 Klassische Aufbereitungsmethoden.........................................................................60
3.7.2 Annexin-V basierte Aufbereitungsmethoden............................................................61
3.8 In-vitro Modelle der assistierten Reproduktion...................................................65
3.8.1 Simulation
IVF: Hamsteroozytenpenetrationstest
....................................................65
3.8.2 Simulation ICSI: Hamster-ICSI.................................................................................66
4 ERGEBNISSE.............................................................................................68
4.1 Nachweis der transkriptioneilen
Inaktivitet
humaner Spermien,..............».......68
4.2 Apoptose-assoziierte Signaltransduktion nach verschiedenen pathologischen
Stimuli.....................................................................................................................70
4.2.1 Spezifische Induktion
Тур
-I
und Typ-ll vermittelter Apoptose..................................70
4.2.2 Einfluss oxidativen Stresses auf die Signalwege von
Тур
-l
und-ll vermittelter
Apoptose in humanen Spermatozoen......................................................................72
4.2.3 Autoaktivierung der Caspasenkaskade....................................................................73
4.2.4 Typ-HI vermittelte Apoptose in humanen Spermatozoen.........................................75
4.2.5 Nachweis der Poly-ADP-Ribose-Polymerase-I in humanen Spermatozoen...........76
4.3 Determinierung möglicher Zusammenhänge in der Signaltransduktion von
Kapazitäten und Apoptose...................................................................................78
4.3.1 Kapazitäten und Akrosomenreaktion in Abhängigkeit von der Extemalisierung
Phosphatidylserins...................................................................................................85
4.4 Stabilitätsanalysen Fluoreszenz-basierter
Assays an
humanen Spermatozoen
.................................................................................................................................88
4.5 Potential der Standardaufbereitung im IVF-Labor zur Reduktion von Spermien
mit aktivierter Apoptose-Signalkaskade..............................................................92
4.6 Kombination von Standard-Spermienpräparation und Annexin-V MACS........95
4.7 Integration des Annexin-V MACS in Kryokonservierungsprotokolle................99
4.8 Effekt des Annexin-V MACS auf die Häufigkeit chromosomaler Anomalien in
Spermien...............................................................................................................103
4.9 Effekt der Annexin-V MACS Separation auf das Fertllisierungspotential
humaner Spermien...............................................................................................105
4.9.1 Annexin-V MACS Separation humaner Spermien von gesunden
Donoren
...........106
4.9.2 Annexin-V MACS Separation humaner Spermien von Infertilitätspatienten...........118
4.10 Transfer des Prinzips der Annexin-V Separation auf ein
Festphasenfiltersystem........................................................,..............................130
4.10.1 Effekt der herkömmlichen und kommerziell erhältlichen Glaswollfiltration auf die
Apoptosesignalkaskade.........................................................................................133
4.10.2 Charakterisierung der Annexin-V negativen
Subpopulation
nach MACS und
molekularer Glaswollfiltration.................................................................................134
4.10.3 Separation kryokonservierter Spermien mittels konventioneller und Annexin-V
basierter Glaswollfiltration......................................................................................135
____________________________________________________________________
хш
5 DISKUSSION..............................................................................................137
5.1 Transkriptionelle
Inaktivitet
humaner Spermatozoen.......................................137
5.2 Signaltransduktion während Kapazitation und Apoptose................................139
5.2.1 Präsenz und Funktionalität der Apoptose-Signaltransduktionswege in humanen
Spermien................................................................................................................139
5.2.2 Apoptoseparameter in Spermien von Infertilitätspatienten.....................................144
5.2.3 Korrelation der Apoptose-Parameter zum Fertilisationspotential humaner Spermien
...............................................................................................................................146
5.2.4 Mögliche Schnittstellen von Apoptose und Kapazitations-assoziierter
Signaltransduktion..................................................................................................150
5.3 Entwicklung Annexin-V basierter Spermienseparationssysteme...................154
5.3.1 Potential konventioneller Aufbereitungsmethoden humaner Spermien für die
assistierte Reproduktion.........................................................................................154
5.3.2 Optimierte Implementation des Annexin-V MACS in
Spermienaufbereitungsprotokolle...........................................................................157
5.3.3 Nutzen des Einsatzes des Annexin-V MACS in der assistierten Reproduktion.....159
5.3.4 Einführung neuer Annexin-V basierter Techniken..................................................166
6 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK.................................................167
6.1 Besonderheiten in der Molekularbiologie humaner Spermien........................167
6.2 Signaltransduktion während Apoptose und Kapazitation................................167
6.3 Fertilitätsrelevante Parameter humaner Spermatozoen...................................169
6.4 Möglichkeiten und Limitationen konventioneller und Annexin-V basierter
Separationsysteme.................................................................,...................,........170
7 LITERATURVERZEICHNIS........................................................................172
8 ANHANG....................................................................................................200
8.1 Zusammensetzung der verwendeten Puffer......................................................200
8.2 Zusammensetzung der verwendeten Lösungen...............................................201
8.3 Chemikalien...,......................................................................................................202
8.4 Biologisches Material..........................................................................................203
8.5 Labortechnik.........................................................................................................204
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