Auswachsverhalten von epithelialen Tumorzelllinien aus 3D-Kultur: Standardisierung und Teilautomatisierung der Analytik
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2009
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| adam_text | Titel: Auswachsverhalten von epithelialen Tumorzelllinien aus 3D-Kultur
Autor: Pohmer, Sibylle
Jahr: 2009
Einleitung....................................................................................................................7
1.1. Das multizelluläre Tumor-Sphäroid-Modell (MCTS-Modell)....................................7
1.2. Methoden der Kultivierung von MCTS...................................................................10
1.3. Der Parameter ?Auswachsen aus 3D Kultur.........................................................13
1.4. Aufgabenstellung und Zielsetzung........................................................................14
Material und Methoden.............................................................................................15
2.1. Materialien und Geräte..........................................................................................15
2.1.1. Verwendete Tumorzelllinien............................................................................15
2.1.2. Zellkulturpuffer und -lösungen........................................................................16
2.1.3. Zellkulturmedium.............................................................................................16
2.1.4. Chemikalien und Wirkstoffe.............................................................................16
2.1.5. Kits..................................................................................................................17
2.1.6. Antikörper........................................................................................................17
2.1.7. Einmalmaterialen und Plastikartikel.................................................................18
2.1.8. Geräte.............................................................................................................18
2.1.9. Auswerte- und Analysesoftware......................................................................19
2.2. Beschichtungen von 96-well Mikrotiterplatten.......................................................19
2.2.1. Beschichtung mit Kollagen Typ 1....................................................................19
2.2.2. Beschichtung mit Agarose...............................................................................19
2.3. Methoden der Zellkultivierung...............................................................................20
2.3.1. Monolayerkulturen...........................................................................................20
2.3.2. Sphäroid-Kulturen in ?Liquid Overlay -Technik................................................21
2.3.2.1. Aussaat und Standard-Kulturbedingungen...............................................21
2.3.2.2. Teil-Automatisierung der Sphäroidkultivierung.........................................21
2.4. Methoden der Sphäroidanalytik.............................................................................22
2.4.1. Bestimmung von Sphäroiddurchmesser und-volumen...................................22
2.4.2. Schnittpräparate und Hämatoxylinfärbung.......................................................23
2.4.3. Auswachsverhalten von Sphäroiden...............................................................24
2.4.3.1. Transfer der Sphäroide auf adhärente Oberflächen.................................24
2.4.3.2. Auswachsen von Sphäroiden in 96-well Mikrotiterplatten.........................25
2.4.3.3. Anfärben der Sphäroide/Zellen nach Auswachsen auf 96-well
Mikrotiterplatten........................................................................................................25
2.4.3.4. Bestimmung der Auswachsfläche von Sphäroiden...................................26
2.5. Behandlung von Sphäroid-Kulturen während des Auswachsens mit Wirkstoffen .26
2.6. Hemmung der Proliferation in Sphäroid-Kulturen mittels Mitomycin C...................27
2.6.1. Behandlung der Sphäroide mit Mitomycin C....................................................27
2.6.2. Anti-BrdU-Färbung..........................................................................................27
2.6.3. Ki67-Färbung..................................................................................................28
Ergebnisse................................................................................................................30
3.1. Standardisierung und Teil-Automatisierung der Auswachsanalytik........................30
3.1.1. Optimierung der Methodik des Auswachsverhaltens von Sphäroiden.............30
3.1.1.1. Vergleich verschiedener 96-well Kulturmikrotiterplatten...........................30
3.1.1.1.1. 96-well Flachbodenplatten ?manuell-beschichtet und ?kommerziell-
beschichtet 30
3.1.1.1.2. 96-well Rundbodenplatte ?manuell-beschichet .................................32
3.1.1.2. Umsetztechnik..........................................................................................33
3.1.1.3. Kollagen 1-Beschichtung..........................................................................34
3.1.2. Experimente zur Verbesserung der automatischen Sphäroidanalytik-Färbung
ausgewachsener Zellen................................................................................................35
3.1.3. Teil-Automatisierung der Bestimmung der Auswachsfläche von Sphäroiden .41
3.1.4. Teil-Automatisierung der Analytik im Bereich des Auswachsens durch Einsatz
eines Matrix-Pipettierers...............................................................................................43
3.2. Auswachsverhalten von Kolonkarzinomzelllinien..................................................44
3.2.2. KM12L4a.........................................................................................................45
3.2.3. KM20L2...........................................................................................................47
3.2.4. HCC2998........................................................................................................47
3.2.5. WiDr................................................................................................................48
3.2.6. HCT116...........................................................................................................49
3.2.7. DLD-1 .............................................................................................................50
3.2.8. HCT15..................................................................... ......................................52
3.2.9. Auswachsverhalten der Kolonkarzinomzelllinien im Überblick.........................53
3.3. Einfluss von Mitomycinauf die Proliferation bei Sphäroidkulturen.........................56
3.4. Effekt der Behandlung von Sphäroidkulturen während des Auswachsens mit
Wirkstoffen.......................................................................................................................59
3.4.1. Festlegung der geeigneten Messzeitpunkte bei der Wirkstofftestung..............60
3.4.2. Behandlung mit 5-Flourouracil.........................................................................62
3.4.3. Behandlung mit Irinotecan...............................................................................64
3.4.4. Behandlung mit Carboplatin............................................................................66
3.4.5. Behandlung mit Cisplatin.................................................................................67
3.4.6. Behandlung mit Cyclophosphamid..................................................................69
3.4.7. Behandlung mit WMC-79................................................................................71
3.4.8. Wirkstofftestung im Überblick..........................................................................73
Diskussion................................................................................................................74
4.1. Standardisierung und (Teil-) Automatisierung - Sphäroidanalytik..........................74
4.2. Grundlegende Überlegungen zur Oberflächenbeschichtung mit Kollagen 1..........76
4.3. Auswachsverhalten anderer Kolonkarzinomzelllinien und Proliferationshemmung
mit Mitomycin...................................................................................................................79
4.4. Wirkstofftestung mittels analytischem Endpunkt .Auswachsen aus Sphäroiden .82
Zusammenfassung...................................................................................................87
Literaturverzeichnis...................................................................................................89
Anhang.....................................................................................................................96
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