Die Rolle des Tumorsuppressorproteins p53 bei der Apoptoseregulation glatter Gefäßmuskelzellen der Neointima:
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Autor: Rode, Ariane J.
Jahr: 2009
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ..............................................................................................................4
1. Einleitung und Stand der Forschung .................................................................................6
1.1 Blutgefäßsystem: Angiogenese - Vaskulogenese ................................................6
1.2 Atherosklerose .........................................................................................................8
1.3 Neointimale Hyperplasie - Restenose ................................................................10
1.4 Progenitorzellen ....................................................................................................11
1.5 Apoptoseregulation und Signalwege ..................................................................12
1.6 Tumorsuppressorprotein p53 .............................................................................17
1.7 Apoptoseinduktion und p53-Modulation .........................................................21
1.8 Vaskuläre Prothesen - Patches ..........................................................................24
2. Fragestellung........................................................................................................................26
3. Material und Methoden .....................................................................................................27
3.1 Material .................................................................................................................27
3.1.1 Geräte und Verbrauchsmittel ................................................................27
3.1.2 Verwendete Software ............................................................................28
3.1.3 Testsubstanzen .....................................................................................?28
3.1.4 Reagenzien und Antikörper ..................................................................29
3.1.5 Sonstige Chemikalien ............................................................................30
3.1.6 Puffer und Lösungen .............................................................................31
3.1.7 Zellen ......................................................................................................33
3.2 Methoden ...............................................................................................................35
3.2.1 Zellkultur................................................................................................35
3.2.1.1 Isolation von Zellen ...................................................................35
3.2.1.2 Auftauen und Einfrieren von Zellkulturen ..............................35
3.2.1.3 Beurteilung / Pflege der Zellen ................................................36
3.2.1.4 Lebendzellzahlbestimmung/Trypanblauausschlusstest ........36
1
Inhaltsverzeichnis
3.2.1.5 Passage .......................................................................................36
3.2.1.6 Mycoplasmentest .......................................................................36
3.2.2 Versuchsbedingungen ...........................................................................37
3.2.2.1 MTT - Test - Proliferationsassay (E-screen) ..........................37
3.2.2.2 Durchflusszytometrische Untersuchung ..................................38
3.2.2.3 Extraktion von Gesamtprotein - Proteinbestimmung ............42
3.2.2.4 Western Blot .............................................................................43
3.2.2.5 siRNA .........................................................................................44
3.2.2.6 Transfektion und Transduktion ................................................45
3.2.2.7 Migrationsassay und Proliferation ...........................................47
3.2.2.8 Statistische Auswertung ...........................................................48
4. Ergebnisse...............................................................................................................................49
4.1 Untersuchung der rSMC - MTT-Assay und FACS ........................................49
4.2 Untersuchung der hSMC - MTT-Assay und FACS ........................................56
4.3 Western Blot .........................................................................................................63
4.3.1 Vorversuche in L87-Zellen ...................................................................63
4.3.2 Expression und Regulation von p53 in SMC .......................................67
4.4 siRNA in hSMC der Neointima .........................................................................70
4.4.1 Transfektion von siRNA in hSMC
der Neointima - Magnetofektion ................................70
4.4.2 Tranduktion von siRNA in hSMC
der Neointima - Effizienzanalyse ................................71
4.4.3 Immunologischer Nachweis des p53-Knockdowns .............................73
4.5 Effekte von Formaldehyd und Glutaraldehyd auf SMC:
Proliferation und Migration ...............................................................................74
Inhaltsverzeichnis
5. Diskussion ...............................................................................................................................79
5.1 Vergleichende Untersuchung von SMC
der Media und Neointima ..................................................................79
5.2 Einfluss von Statinen auf die Proliferation und Apoptose in SMC ..............81
5.3 Einfluss von PRIMA-1 und PFTa auf die Apoptose......................................85
5.4 Einfluss von Doxorubicin auf die Apoptose......................................................86
5.5 Expression von p53 und knockdown ..................................................................86
5.6 Unterschiedliche Patchmaterialien und Restenose .........................................89
5.7 Statin-beschichtete Stents zur Restenoseprävention ......................................90
6. Zusammenfassung.................................................................................................................93
7. Literaturverzeichnis .............................................................................................................94
8. Anhang ..................................................................................................................................106
9. Publikationen und Kongressbeiträge ...............................................................................108
10. Danksagung........................................................................................................................110
11. Lebenslauf ...........................................................................................112
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