Molekulare Ursachen interstitieller Lungenerkrankungen:
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| adam_text | Titel: Molekulare Ursachen interstitieller Lungenerkrankungen
Autor: Sparr, Christiane
Jahr: 2009
Inhaltsverzeichnis__________________________________________________________________________[_
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis.....................................................................................................1
1 Einleitung..........................................................................................................4
1.1 Interstitielle Lungenerkrankungen.......................................................................4
1.2 Zusammensetzung und physiologische Rolle von Surfactant.............................5
1.2.1 Proteinanteil des Surfactants..............................................................................6
1.2.2 Lipidanteil des Surfactants..................................................................................7
1.3 Prozessierung der Surfactantproteine...............................................................10
1.4 Struktur und Funktion von Surfactantprotein C.................................................12
1.5 Prozessierung von Surfactantprotein C............................................................12
1.6 Surfactantprotein-C-Mutationen und ihre Auswirkungen...................................13
2 Zielsetzung......................................................................................................17
2.1 Analyse der Prozessierungsintermediate..........................................................17
2.2 Morphologie der Lamellarkörperchen...............................................................18
2.3 Intrazelluläre Lokalisierung von proSP-C..........................................................18
2.4 Verhalten gegenüber exogenem Stress............................................................18
2.5 Einfluss der proSP-C-Expression auf die Hitzeschockproteinexpression.........19
2.6 Zelluläre Lipidzusammensetzung......................................................................20
2.7 Stimulation der Rezeptorexpression auf Immunzellen durch lösliche
Faktoren im Kulturüberstand.............................................................................20
3 Material und Methoden...................................................................................21
3.1 Material.............................................................................................................21
3.1.1 Geräte und Verbrauchsmaterial........................................................................21
3.1.2 Fertiggebinde....................................................................................................22
3.1.3 Chemikalien......................................................................................................23
3.1.4 Sonstige Reagenzien........................................................................................24
3.1.5 Zellkulturmedien................................................................................................25
3.1.6 Puffer und Lösungen.........................................................................................25
3.1.7 Verwendete Zelltypen.......................................................................................26
3.1.8 Antikörper.........................................................................................................27
3.1.9 Vektoren................................ ...28
3.1.9.1 pcDNA3/HA-hSP-C?............. ......29
3.1.9.2 pEGFP-CI/hSP-C? und pEGFP-NI/hSplc?..............................................30
3.1.9.3 Erzeugte Vektoren........................................................................................31
3.1.10 Oligonukleotide.................................................................................................32
3.2 Methoden..........................................................................................................33
Kultivierung und Aufbewahrung von E.coli........................................................33
Vorbereitung der Kulturschalen für E.coli-Kulturen.......................................33
E.coli-Zellkultur.............................................................................................33
Herstellung rubidiumchloridkompetenter E.coli-Zellen..................................33
Transformation von Plasmid-DNA in E.coli-Zellen........................................34
Allgemeine Zellkulturtechniken.........................................................................35
Einfrieren der Zellen.....................................................................................35
Auftauen der Zellen.......................................... ..........................35
Viabilitätstestung...........................................................................................35
Mykoplasmentest......... ........36
Zelllysat............................................................ [ . . . . . . .. ............................37
Selektionskonzentration des Antibiotikums...................................................37
Transfektion..................................................................................................38
Arzneimittel-Vorbehandlung der Kulturen.....................................................39
Dichtegradientenzentrifugation zur Isolation der Lamellarkörperchen..........39
Isolation der Large Aggregates.....................................................................40
Lymphozyten-/ Neutrophilenisolation...........................................................41
DNA-Methoden.................................................................................................42
Mini-Präparation von Plasmid-DNA aus E.coli..............................................42
Maxi-Präparation von Plasmid-DNA aus E.coli.............................................42
Restriktionsanalyse von DNA.......................................................................43
Agarosegelelektrophorese von DNA.............................................................43
Quantifizierung von DNA..............................................................................44
Polymerase-Kettenreaktion..................... ..........................4*
Punktmutagenese mittels PCR.....................................................................45
DNA-Sequenzierung.....................................................................................46
Biochemische Methoden...................................................................................46
Quantitative Proteinbestimmung ...................^
LDH-Assay....................................................... .................................46
3.2.1
3.2.1.1
3.2.1.2
3.2.1.3
3.2.1.4
3.2.2
3.2.2.1
3.2.2.2
3.2.2.3
3.2.2.4
3.2.2.5
3.2.2.6
3.2.2.7
3.2.2.8
3.2.2.9
3.2.2.10
3.2.2.11
3.2.3
3.2.3.1
3.2.3.2
3.2.3.3
3.2.3.4
3.2.3.5
3.2.3.6
3.2.3.7
3.2.3.8
3.2.4
3.2.4.1
3.2.4.2
Inhaltsverzeichnis
3.2.5 Zellbiologische Methoden.................................................................................47
3.2.5.1 Austestung der verträglichen Arzneimittelkonzentration...............................47
3.2.5.2 Elektronenmikroskopie.................................................................................48
3.2.5.3 Analyse der Phospholipide mittels Massenspektrometrie.............................49
3.2.6 Immunologische Methoden...............................................................................50
3.2.6.1 1D-SDS-PAGE.............................................................................................50
3.2.6.2 Coomassie-Färbung des SDS-Gels..............................................................50
3.2.6.3 Silberfärbung des SDS-Gels.........................................................................51
3.2.6.4 Immunodetektion mittels Westemblot...........................................................51
3.2.6.5 Immunohistochemie......................................................................................52
3.2.6.6 Durchflusszytometrie....................................................................................53
3.2.7 Statistik.............................................................................................................55
4 Ergebnisse.......................................................................................................56
4.1 Allgemeine Vorarbeiten.....................................................................................56
4.1.1 Erzeugung verschiedener Zielvektoren.............................................................56
4.1.2 Transfektion......................................................................................................61
4.1.2.1 Optimierung der Transfektionseffizienz........................................................61
4.1.2.2 Stabile Transfektion......................................................................................62
4.1.3 Austestung der verträglichen Arzneimittelkonzentration...................................63
4.1.4 LDH-Assay zum Toxizitätsausschluss..............................................................65
4.2 Prozessierung von Wildtyp proSP-C im Vergleich zu mutiertem proSP-C........66
4.2.1 Entwicklung eines Modells zur Identifizierung verschiedener SP-C
Prozessierungsstufen.......................................................................................66
4.2.2 Analyse der Prozessierungsintermediate bei l73T-mutiertem proSP-C im
Vergleich zu Wildtyp proSP-C...........................................................................69
4.2.3 Analyse der Prozessierungsintermediate bei l73T-mutiertem proSP-C im
Vergleich zu Prozessierungsintermediaten, die in der Lungenflüssigkeit
von Patienten gefunden wurden.......................................................................72
4.2.4 Analyse der Prozessierungsintermediate bei A116D-mutiertem proSP-C
im Vergleich zu Wildtyp proSP-C......................................................................73
4.2.5 Analyse der Prozessierungsintermediate bei P30L-, L110R-, P115L- oder
L188Q-mutiertem proSP-C im Vergleich zu Wildryp proSP-C...........................75
4.3 Morphologie der Lamellarkörperchen...............................................................77
4.3.1 Morphologie der Lamellarkörperchen bei Wildryp proSP-C und I73T- oder
A116D-mutiertem pro SP-C..............................................................................78
4.3.2 Morphologie der Lamellarkörperchen bei P30L-, L110R-, P115L- oder
L188Q-mutiertem proSP-C...............................................................................80
4.4 Intrazelluläre Lokalisierung der Zwischenformen von proSP-C........................82
IV
4.5 Verhalten von transfizierten MLE-12-Zellen gegenüber exogenem Stress.......85
4.6 Einfluss der proSP-C-Expression auf die Hitzeschockproteinexpression.........86
4.6.1 Expression der Hitzeschockproteine bei Wildtyp proSP-C, I73T- und
A116D-mutiertemproSP-C...............................................................................^
4.6.2 Expression der Hitzeschockproteine bei Wildtyp proSP-C, P30L-, L110R-,
P115L- und L188Q-mutiertem proSP-C............................................................M
4.7 Zelluläre Lipidzusammensetzung......................................................................90
4.7.1 Analyse der Lipidzusammensetzung des Zelllysates........................................91
4.7.1.1 Darstellung der Unterschiede innerhalb der einzelnen Lipidklassen des
Zelllysates.....................................................................................................94
4.7.1.2 Betrachtung der Auffälligkeiten der einzelnen Fettsäuren der jeweiligen
Lipidklassen des Zelllysates......................................................................... 7
4.7.2 Analyse der Lipidzusammensetzung des Kulturüberstandes............................99
4.7.2.1 Darstellung der Unterschiede innerhalb der einzelnen Lipidklassen des
Kulturüberstandes.......................................................................................102
4.7.2.2 Betrachtung der Auffälligkeiten der einzelnen Fettsäuren der jeweiligen
Lipidklassen des Kulturüberstandes...........................................................105
4.7.3 Korrektives Potential von Methylprednisolon und Hydroxychloroquin.............1 7
4.7.4 Gegenüberstellung LipkJmessung von Zelllysat und Kulturüberstand.............108
4.8 Analyse der Rezeptorexpression auf Immunzellen.........................................11°
4.8.1 Oberflächenexpression von CCR-2 auf Lymphozyten....................................11°
4.8.2 Oberflächenexpression von CXCR-1 auf Lymphozyten..................................111
4.8.3 Oberflächenrezeptorexpression von CXCR-1 undCD11bauf Neutrophilen.. 111
5 Diskussion.....................................................................................................113
5.1 Prozessierungsmuster....................................................................................113
5.2 Morphologie der Lamellarkörperchen.............................................................116
5.3 Intrazelluläre Lokalisierung der Zwischenformen von proSP-C......................116
5.4 Verhalten gegenüber exogenem Stress..........................................................117
5.5 Einfluss der proSP-C-Expression auf die Hitzeschockproteinexpression.......H8
5.6 Zelluläre Lipidzusammensetzung....................................................................119
5.7 Stimulation der Rezeptorexpression auf Immunzellen....................................120
Inhaltsverzeichnis
6 Zusammenfassung.......................................................................................122
7 Anhang..........................................................................................................124
7.1 Datenverzeichnis............................................................................................124
7.1.1 Viabilitätstests.................................................................................................124
7.1.2 Zelluläre Lipidzusammensetzung....................................................................130
7.1.2.1 Originalmessdaten Lipide - Vorversuch......................................................131
7.1.2.2 Originalmessdaten Lipide - Hauptversuch..................................................134
7.1.2.3 Originalmessdaten der Fettsäurekomponenten von Phosphatidylcholin ....139
7.1.2.4 Originalmessdaten der Fettsäurekomponenten von
Lysophosphatidylcholin...............................................................................144
7.1.2.5 Originalmessdaten der Fettsäurekomponenten von
Phosphatidylglycerol...................................................................................147
7.1.2.6 Originalmessdaten der Fettsäurekomponenten von Sphingomyelin...........149
7.1.2.7 Originalmessdaten der Fettsäurekomponenten von Ceramid und
Glucosylceramid.........................................................................................151
7.1.2.8 Ergebnisse des Vorversuches....................................................................153
7.2 Literaturverzeichnis.........................................................................................159
7.3 Tabellenverzeichnis........................................................................................166
7.4 Abbildungsverzeichnis....................................................................................167
7.5 Danksagung....................................................................................................170
7.6 Lebenslauf......................................................................................................171
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