Kalzium-Signaling in trachealen Muskelzellen von T-bet KO-(Asthma-) und Wildtyp-Mäusen:
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2009
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| adam_text | Titel: Kalzium-Signaling in trachealen Muskelzellen von T-bet KO-(Asthma-) und Wildtyp-Mäusen
Autor: Günther, Juliane
Jahr: 2009
Inhalt
Inhalt.....................................................................................................................3
Abbildungsverzeichnis........................................................................................7
Abkürzungsverzeichnis.......................................................................................9
1 Einleitung und Fragestellung....................................................................11
1.1 Einleitung................................................................................................................11
1.2 Fragestellung...........................................................................................................16
2 Material und Methoden.............................................................................17
2.1 Material...................................................................................................................17
2.2 Kultivierung der murinen trachealen glatten Muskelzellen..............................20
2.2.1 Grundlagen zu den Mauslinien........................................................................20
2.2.1.1 BALB/c........................................................................................................20
2.2.1.2 T-bet KO......................................................................................................20
2.2.2 Gewinnung der Zellen für die Primärkultur.....................................................21
2.2.3 Kulturbedingungen...........................................................................................21
2.3 Auszählung des Anteils glatter Muskelzellen in der Kultur..............................22
2.3.1 Grundlagen zum Aktin.....................................................................................22
2.3.2 Antikörperfärbung............................................................................................24
2.4 Färbung mit Oregon Green...................................................................................25
2.5 Aufzeichnung der Messungen...............................................................................25
2.6 Methodik der Untersuchungen zur Kalziumhomöostase...................................26
2.6.1 Untersuchung des Acetylcholin-induzierten Kalzium-Signalings...................26
2.6.1.1 Grundlagen zu Acetylcholin und Acetylcholinrezeptor...............................26
2.6.1.2 Anwendung von Acetylcholin......................................................................27
2.6.2 Anwendung von Acetylcholin in kalziumfreiem Medium...............................27
2.6.3 Messungen spontaner Fluoreszenzänderungen in EDTA-Lösung...................28
2.6.4 Untersuchung der Beteiligung von IP3-Rezeptoren.........................................28
2.6.4.1 Grundlagen zum DVRezeptor......................................................................28
2.6.4.2 Grundlagen zum Xestospongin....................................................................29
2.6.4.3 Anwendung von Xestospongin D................................................................29
2.6.5 Untersuchung der Beteiligung von Ryanodinerezeptoren................................30
2.6.5.1 Grundlagen zum Ryanodinerezeptor............................................................30
2.6.5.2 Grundlagen zum Ryanodine.........................................................................30
2.6.5.3 Anwendung von Ryanodine.........................................................................30
2.6.6 Untersuchung des Kalziumgehaltes des SR.....................................................31
2.6.6.1 Grundlagen zumCaffeine............................................................................31
2.6.6.2 Anwendung von Caffeine.............................................................................31
2.6.6.3 Grundlagen zur SERCA...............................................................................31
2.6.6.4 Grundlagen zum CPA..................................................................................32
2.6.6.5 Anwendung von CPA...................................................................................33
2.6.6.6 Grundlagen zu Thapsigargin........................................................................33
2.6.6.7 Anwendung von Thapsigargin.....................................................................34
2.7 Auswertung der Bilddateien..................................................................................34
2.8 Ermitteln der Daten für die statistische Auswertung.........................................40
2.9 Statistische Auswertung.........................................................................................42
2.10 Darstellung der Graphen.......................................................................................42
3 Ergebnisse...................................................................................................43
3.1 Auszählung des Anteils glatter Muskelzellen in der Kultur.............................. 43
3.2 Acetylcholin-induziertes Kalzium-Signaling.......................................................43
3.2.1 Allgemeines......................................................................................................43
3.2.2 Initialer Transient.............................................................................................44
3.2.3 Anstiegsgeschwindigkeit des initialen Transienten.........................................45
3.2.4 Abfallsgeschwindigkeit des initialen Transienten............................................46
3.2.5 Oszillationen.....................................................................................................47
3.3 Acetylcholin-induziertes Kalzium-Signaling in kalziumfreiem Medium.......... 49
3.4 Spontanes Kalzium-Signaling in kalziumfreiem Medium........???»«? *u
3.4.1 Allgemeines......................................................................................................50
3.4.2 Maximale Fluoreszenzänderung......................................................................51
3.4.3 Anstiegsgeschwindigkeit der maximalen Fluoreszenzänderung......................52
3.4.4 Abfallsgeschwindigkeit der maximalen Fluoreszenzänderung........................53
3.4.5 Häufigkeit der Fluoreszenzänderungen............................................................54
3.5 Acetylcholin-induziertes versus spontanes Kalzium-Signaling.........?....? 56
3.5.1 Initialer Transient versus maximale Fluoreszenzänderung..............................56
3.5.1.1 BALB/c........................................................................................................56
3.5.1.2 T-betKO......................................................................................................56
3.5.2 Anstiegsrate......................................................................................................57
3.5.2.1 BALB/c........................................................................................................57
3.5.2.2 T-bet KO......................................................................................................57
3.5.3 Abfallsrate........................................................................................................59
3.5.4 Anzahl der Oszillationen und Fluoreszenzänderungen....................................61
3.6 Beteiligung von IP3- Rezeptoren............................................................................65
3.7 Beteiligung von Ryanodinerezeptoren.................................................................67
3.8 Kalziumgehalt des Sarkoplasmatischen Retikulums..........................................69
3.8.1 Untersuchung mit Caffeine..............................................................................69
3.8.2 Untersuchung mit CPA....................................................................................69
3.8.3 Untersuchung mit Thapsigargin.......................................................................69
3.9 Zusammenfassung der Ergebnisse....._________.?.?.?......................------71
4 Diskussion___________________.??.?..??.........._______________73
4.1 Diskussion der Materialien und Methoden_________........................................73
4.1.1 Monolayer-Zellkultur, Gewinnung und Kultivierung......................................73
4.1.2 Primärkultur aus trachealen glatten Muskelzellen...........................................76
4.1.3 Die T-bet KO-Maus als Asthmamodell...........................................................78
4.1.4 Färbung der Zellen und Mikroskopie...............................................................80
4.1.5 Ermittlung der Messwerte................................................................................84
4.2 Diskussion der Ergebnisse__________.____.................___...-----------.....__.....86
4.2.1 Acetylcholin-induziertes Kalzium-Signaling...................................................86
4.2.1.1 Allgemeines..................................................................................................86
4.2.1.2 Kalziumsignale.............................................................................................87
4.2.2 Acetylcholin-induziertes Kalzium-Signaling in kalziumfreiem Medium........90
4.2.3 Spontanes Kalzium-Signaling in kalziumfreiem Medium...............................91
4.2.3.1 Allgemeines..................................................................................................91
4.2.3.2 Kalziumsignale.............................................................................................92
4.2.4 Beteiligung von HVRezeptoren.......................................................................95
4.2.5 Beteiligung von Ryanodinerezeptoren.............................................................96
4.2.6 Kalziumgehalt des Sarkoplasmatischen Retikulums........................................91
5 Zusammenfassung, Schlußfolgerung, Ausblick....................................101
Literaturverzeichnis........................................................................................105
Anhang..............................................................................................................111
Danksagung......................................................................................................119
Lebenslauf........................................................................................................121
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