Holdings: Identifizierung und Charakterisierung von Moco-bindenden Proteinen aus Arabidopsis thaliana

Identifizierung und Charakterisierung von Moco-bindenden Proteinen aus Arabidopsis thaliana:

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Main Author:	Kruse, Tobias (Author)
Format:	Thesis Book
Language:	German
Published:	2009
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adam_text	IDENTIFIZIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON MOCO-BINDENDEN PROTEINEN AUS ARABIDOPSIS THALIANA VON DER FAKULTAT FUR LEBENSWISSENSCHAFTEN DER TECHNISCHEN UNIVERSITAT CAROLO-WILHELMINA ZU BRAUNSCHWEIG ZUR ERLANGUNG DES GRADES EINES DOKTORS DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR. RER. NAT.) GENEHMIGTE DISSERTATION VON TOBIAS KRUSE AUS FIIRTH INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG 1.1 MOLYBDAN IN BIOLOGISCHEN SYSTEMEN 1 1.2 DER MOLYBDANCOFAKTOR 1 1.3 DIE STRUKTUR DES MOLYBDANCOFAKTORS 2 1.4 DIE BIOSYNTHESE DES MOLYBDANCOFAKTORS 3 1.5 MODIFIZIERUNGEN DES MOLYBDANCOFAKTORS 6 1.6 MOCO-BINDENDE PROTEINE 6 1.7 ZIELE DER ARBEIT 9 2 ERGEBNISSE 2.1 IDENTIFIZIERUNG VON TERTIARSTRUKTURHOMOLOGEN ZU CHLAMYDOMONAS MCP IN ARABIDOPSIS THALIANA 10 2.2 HOMOLOGE ZU CHLAMYDOMONAS MCP IN ARABIDOPSIS THALIANA 17 2.3 HOMOLOGE ZU CHLAMYDOMONAS MCP IN ANDEREN ORGANISMEN 19 2.4 MDGLICHE CHLAMYDOMONAS MCP-HOMOLOGE IN EUKARYOTEN 21 2.5 KLONIERUNG, REKOMBINANTE UBEREXPRESSION UND AUFREINIGUNG VON PUTATIVEN ARABIDOPSIS MBP 23 2.6 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG VON PUTATIVEN ARABIDOPSIS MBP 24 2.6.1 BESTIMMUNG DER APPARENTEN MOLEKULAREN MASSE PUTATIVER ARABIDOPSIS MBP 24 2.6.2 IDENTIFIZIERUNG VON DIMERISIERUNGSBETEILIGTEN AMINOSAUREN 25 2.6.3 NACHWEIS VON PROTEINGEBUNDENEM MOCO/MPT NACH NI-NTA- CHROMATOGRAPHIE 28 2.6.4 IN WFRO-MOCO-BINDUNG AN PUTATIVE MBP AUS ARABIDOPSIS 29 2.6.5 LOKALISIERUNG DES MOCO-BINDUNGSMOTIVES 35 2.6.6 DIE STRUKTUR DER MBP C-TERMINI 41 2.6.7 DIE GENSTRUKTUR VON ARABIDOPSIS MBP 43 2 6.8 REDOXEIGENSCHAFTEN DER MBP 44 2 6 9 DIE REDOXABHANGIGE MOCO/MPT-BINDUNG DURCH MBP3 UND MBP5 49 2.6.10 MODELL DER MOCO-BINDUNG 52 2 7 MOCO/MPT-BINDUNG DURCH CNX1E 55 2 8 DIE PHYSIOLOGIE VON ARABIDOPSIS MBP 61 2 81 ARABIDOPSIS MBP-KNOCK-OUT-P1 ANZEN 61 INHALTSVERZEICHNIS 2.8.2 ERZEUGUNG VON ARABIDOPSIS MBP-ANF/SENSE-PFLANZEN 62 2.8.3 CHARAKTERISIERUNG VON MBP-KNOCK-OUT- UND ANF/SENSE-PFLANZEN 63 2.8.4 DER EINFLUG DER MBP AUF N/Y-)-REKONSTITUTIONSAKTIVITAT 66 2.8.5 DIE EXPRESSIONSMUSTER VON ARABIDOPSIS MBP 68 3 DISKUSSION 74 3.1 IDENTIFIZIERUNG VON MBP IN ARABIDOPSIS 74 3.2 HOMOLOGE VON CHLAMYDOMONAS MCP UND ARABIDOPSIS MBP IN ANDEREN ORGANISMEN 74 3.3 SIND ARABIDOPSIS MBP FUNKTIONSHOMOLOG ZU CHLAMYDOMONAS MCP? 77 3.4 DIE DIMERE KONSTITUTION DER ARABIDOPSIS MBP 77 3.5 MOCO/MPT-BINDUNG DURCH ARABIDOPSIS MBP 78 3.6 DIE ARABIDOPSIS MBP C-TERMINI SIND BETEILIGT AN MOCO/MPT- BINDUNG 81 3.7 DIE MOCO/MPT-BINDUNG DURCH MBP3 UND MBP5 IST REDOXSENSITIV 82 3.8 DAS BINDUNGSMODELL VON MOCO AN ARABIDOPSIS MBP 84 3.9 MOCO/MPT-BINDUNG DURCH CNX1 E 84 3.10 PHYSIOLOGISCHE AUFGABEN VON ARABIDOPSIS MBP 85 3.11 AUSBLICK 87 4 MATERIAL UND METHODEN 89 4.1 MATERIAL 89 4.1.1 VERWENDETE MEDIEN, PUFFER UND LOSUNGEN 89 4.1.2 CHEMIKALIEN UND ENZYME 89 4.1.3 VERWENDETE ORGANISMEN 89 4.1.4 VERWENDETE PLASMIDE 90 4.1.5 VERWENDETE PRIMER 90 4.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE ARBEITEN 93 4.2.1 KLONIERUNGSTECHNIKEN 93 4.2.2 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 93 4.2.2.1 FUSIONS-PCR 93 4.2.2.2 KLONIERUNGS-PCR 94 4.2.3 DNA-SEQUENZIERUNG 94 4.2.4 RNA-LSOLATION 94 4.2.5 REVERSE TRANSKRIPTASE (RT)-REAKTION 95 INHALTSVERZEICHNIS 4.3 ARBEITEN MIT ARABIDOPSIS THALIANA 95 4.3.1 PFLANZENANZUCHT 95 4.3.2 EMTE VON ARABIDOPSIS-SAMEN 96 4.3.3 STERILISATION VON ARABIDOPSIS-SAMEN 96 4.3.4 SELEKTION TRANSGENER PFLANZEN 97 4.3.5 HERSTELLUNG HOMOZYGOTER /CNOC/C-OUF-PFLANZEN 97 4.3.6 NACHWEIS VON ENZYMAKTIVITATEN IN ARABIDOPSIS 98 4.3.6.1 BESTIMMUNG DER NITRATREDUKTASE-AKTIVITAT 98 4.3.6.2 BESTIMMUNG DER SULFITOXIDASE-AKTIVITAT 98 4.3.6.3 NACHWEIS DER AKTIVITATEN VON ALDEHYDOXIDASEN UND XANTHINDEHYDROGENASE 99 4.4 PROTEINBIOCHEMISCHE ARBEITEN 100 4.4.1 REKOMBINANTE FREMDGENEXPRESSION IN E. COLI 100 4.4.2 AFFINITATSCHROMATOGRAPHISCHEAUFREINIGUNG HIS-GETAGGTER PROTEINE 100 4.4.3 BESTIMMUNG VON PROTEINKONZENTRATIONEN 101 4.4.3.1 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION VON GEREINIGTEN PROTEINEN 101 4.4.3.2 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION VON ZELLEXTRAKTEN 101 4.4.4 UMPUFFERN VON PROTEINLOSUNGEN 102 4.4.5 KONZENTRIERUNG VON PROTEINLOSUNGEN 102 4.4.6 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE(SDS-PAGE) 102 4.4.7 NATIVE POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (NATIVE PAGE) 102 4.4.8 GELFILTRATION 103 4.4.9 ANIONENAUSTAUSCHER-CHROMATOGRAPHIE 103 4.4.10 MOCO/MPT-BINDUNG AN ARABIDOPSIS MBP 103 4.4.11 MOCO/MPT-NACHWEIS UBER FORMA-DEPHOSPHO 104 4.4.12 DISULFID-DITHIOL-REDOXTITRATION 105 4.4.13 REDUKTION VON CNX1E DURCH MATRIX-GEKOPPELTES TCEP 107 4.4.14 NACHWEIS FREIER SULFHYDRYLGRUPPEN DURCH DTNB 107 4.4.15 /V/M-REKONSTITUTIONSASSAY ZUM NACHWEIS VON MOCO/MPT 107 4.4.16 MALDI-MS BASIERTE IDENTIFIZIERUNG VON REDOXSENSITIVEN CNX1E CYSTEINRESTEN 108 5 ZUSAMMENFASSUNG 109 6 LITERATURVERZEICHNIS 110
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