Generierung und Charakterisierung eines verbesserten ciliary neurothrophic factors (CNTF):
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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2009
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| adam_text | Titel: Generierung und Charakterisierung eines verbesserten ciliary neurothrophic factors (CNTF)
Autor: Breusing, Kati
Jahr: 2009
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung 1
I Einleitung 2
1.1 Zytokine 2
1.2 IL-6-Familie 2
1.3 Ciliar) Neurotrophic Factor 3
1.3.a Signaltransduktion von CNTF 4
1.3.a.I Die klassische Signaltransduktion von CNTF 4
über den CNTF Rezeptor
1.3.a.II Alternative Signal-Initiierung :CNTF über 5
den IL-6 Rezeptor
I.3.b Neurotrophe Wirkungen von CNTF 6
I.3.c Muskuläre Veränderungen durch CNTF 7
I.3.d Metabolische Effekte von CNTF 7
I.3.e Leptin und die Regulierung der Nahrungsaufnahme 8
1.3.f Vergleiche zwischen Leptin und CNTF 9
1.4 Adipositas 10
I.4.a Adipositas allgemein 10
I.4.b CNTF gegen Adipositas 11
1.5 Molekül-Interaktionen 12
- Elektrostatische Wechselwirkungen 12
- Van-der-Waals-Wechselwirkungen 13
- Hydrophobe Wechselwirkungen 13
1.6 Molecular Modelling 13
1.7 Interaktion zwischen CNTF und seinem ß-Rezeptor gpl30 14
1.8 Zielsetzung: Verbesserung der Bindungseigenschaften von 15
CNTF auf Basis von Axokine®
II Ergebnisse u
H.1 Klonierung von CNTF-Varianten mit optimierten gpl30- 16
Bindungsepitopen
H.l.a Konstruktion von ?dl4dl5-C17A-CNTF 17
Il.l.b Konstruktion von ?dl4dl5-C17A-Q63R-CNTF 17
II. 1 x Konstruktion von 7 CNTF-cDNA-Derivaten 9
II. 1 .d Wechsel der Strategie von ?PCR-Ligations-PCR 23
zur ?Plasmidkombination
II.2 Bakterielle Expression der CNTF-cDNA-Derivate 24
U.3 Optimierungsversuche zur Expression der ?K26LD30I 26
enthaltenden cDNA s
I1.3.a Expressionsversuch von K26I_D30I_Q122L_CNTF 26
in anderen E. coli Stämmen
II.3.b Subklonierung der cDNA ?K26I_D30I_CNTF 27
in pET-22b (5733kb)
II.3.C Codon-Austausch von CGA-»CGT 28
n.4 Dialyse der exprimierten CNTF-Derivate ^0
II.4.a Optimierung des Dialyse-Puffers bei Ql 15L-CNTF 31
II.5 Größenausschluss-Chromatographie 32
Il.S.a Größenausschluss-Chromatographie von 32
dl4dl5-CNTF. dl4dl5-C17A-CNTF,
dl4dl5-C17A-Q63R-CNTF und Q122L-CNTF
II.5.b Größenausschluss-Chromatographie von Ql 15L-CNTF 33
undQ115L-Q122L-CNTF
II.5.C Größenausschluss-Chromatographie von Ql 15L-CNTF 35
nach Solubilisierung in IM Harnstoff
H.6 CD-Spektren der CNTF-Derivate 36
n.7 Analyse der biologischen Aktivität der CNTF-Varianten 37
II.7.a Proliferationsassays mit 37
BaF/3- (gpl30.LIF-R.CNTF-R)- Zellen
II.7.b Proliferationsassays mit 39
BaF/3- (gpl30. LIF-R. IL-6-R)- Zellen
1I.7.C Negativ-Kontrollen mit BaF/3- (gpl30, L1F-R)- 40
und BaF/3-(gp 130)-Zellen
III Diskussion 42
111.1 Die Entwicklung von CNTF 42
111.2 Herstellung der cDNA 43
IIIJ Expression der cDNA und Herstellung der Proteine 44
111.4 CD-Spektren 44
111.5 Assays mit BaF/3-Zellen 45
111.6 Fazit 45
IV Literaturreferenzen 46
V Methoden 51
V.l. Transformation 51
V.2. Vektoramplifikation und -präparation 52
V3. Polymerase Ketten Reaktion, PCR 54
V.4. DNA-Aufarbeitung 56
V.4.a Restriktionsenzyme 56
V.4.b DNA-Reinigung 57
V.4.C Vektor-Dephosphorylierung 58
V.4.d Phosphorylierung 58
V.4.e Ligation 59
V.4.f DNA-Konzentrationsbestimmung 59
V.5. Agarose-Gelelektrophorese 59
V.6. Expression, Reinigung und Analyse rekombinanter Proteine 60
aus E. coli
V.6.a Proteinexpression 61
V.6.b Disruption/Proteinreinigung 61
V.6.C Renaturierung und Pufferwechsel mit Hilfe der Dialyse 62
V.6.d Konzentrationsbestimmung durch UV-Absorptionsmessung 63
V.6.e Größen-Ausschluss-Chromatographie 64
IV.ö.f Circular Dichroismus (CD-) Spektropolarimetrie 64
V.7 Proteinanalytik 65
V.7.a Diskontinuierliche Polyacrylamidgelelektrophorese 65
V.7.b Coomassie-Färbung (Bradford-Assay) 67
V.7.C Silberfärbung 67
V.8 Zellkultur 68
V.8.a Allgemeines 68
V.8.b Gefrierkulturen 68
V.8.C Proliferationsversuche 69
VI Material 71
VII Abkürzungen 79
VIII Anhang 81
VIII. 1 Aminosäuresequenzen 81
Vm.2 DNA-Sequenzen 84
VDI.3 CD-Spektren 87
Danksagung 89
Lebenslauf 90
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