Identifizierung von mit dem Ionenkanal TRPN1 assoziierten Proteinen:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2008
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| adam_text | Titel: Identifizierung von mit dem Ionenkanal TRPN1 assoziierten Proteinen
Autor: Herr, Rudolf
Jahr: 2008
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis *
I.Einleitung 1
1.1 Das Ohr 1
1.2 Haarsinneszellen 1
1.3 Der Hörsinn 2
1.3.1 Das gating spring - Modell 4
1.3.2 Adaptation 4
1.4 Der mechanosensitive lonenkanal 5
1.5NOMPC(TRPN1) 7
1.5.1 TRPN1 in Drosophila melanogaster 7
1.5.2 TRPN1 in Caenorhabditis elegans 9
1.5.3 TRPN1 in Danio rerio 9
1.5.4 TRPN1 in Xenopus laevis 10
1.5.5 Ankyrin repeats ^
1.6 Weitere Molekulare Komponenten der Haarzellen 13
1.6.1 MitderTektorial-Membran assoziierte Proteine 14
1.6.2 Mit dem Stereozilienbündel assoziierte Proteine 15
2. Materialien und Methoden 20
2.1 Materialien 20
2.1.1 Geräte 20
2.1.2 Chemikalien/Lösungen 21
2.1.3 Reagenzien-Sets (Kits) 25
2.1.4 Verbrauchsmaterialien 25
2.2 Methoden 26
2.2.1 Yeast-two-hybrid („Hefe-2-Hybrid ) 26
2.2.1.1 Das Prinzip 26
2.2.1.2 Die Durchführung 30
2.2.1.2.1 Konstruktion der Fusionsgene („Baits ) 30
2.2.1.2.2 cDNA-Bank 33
2.2.1.2.3 Sequenzielte Transformation der Hefe (Library scate) 35
2.2.2 Analyse und Verifikation der putativ positiven Klone 38
2.2.2.1 ß-Galaktosidase - Filter - Untersuchung 38
2.2.2.2 Plasmid-Extraktion aus der Hefe 39
2.2.2.3 Vervielfältigung der Plasmid-DNA in E.coli 40
2.2.2.3.1 Vorbereitung von etektrokompetenten E.coli Zellen 40
2.2.2.3.2 Transformation durch Elektroporation 40
2.2.2.4 Yeast-two-hybrid-Negativkontrollen der Klone 41
2.2.2.5 Sequenzierung der Klone 41
2.2.3 Ko-Immunpräzipitation 42
2.2.3.1 Das Prinzip 42
2.2.3.3 cRNA-Synthese 45
2.2.3.4 Xenopus-Iaevis-Oozyten als Expressionssystem 46
2.2.3.5 Expressionskontrollen der Konstrukte 48
2.2.3.6 Ko-Expression und Ko-Immun-Präzipitation 49
2.2.3.6.1 Protein-Präparation für zytoplasmatische Proteine 50
2.2.3.6.2 Membran-Präparation für Membran-Proteine 51
2.2.3.7 SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) 52
2.2.3.8 Western-Blot 55
3. Ergebnisse 57
3.1 Yeast-two-Hybrid Versuche 57
3.1.1 Bait Nl 57
3.1.2 Bait Nil 62
3.1.3 Bait Cll 67
3.1.4 ß-Galaktosidase-Filter-Test 69
3.2 Die Ko-Immun-Präzipitation 70
3.2.1 Subklonierung der Bait-Konstrukte 71
3.2.2 Ko-Präzipitation ausgewählter Klone aus Screen 3 73
3.2.3 Ko-Präzipitation ausgewählter Klone aus Screen 4 76
4. Diskussion 80
4.1 Kandidaten für den Haarzelltransduktionskanal 80
4.1.1 Amilorid-sensitive Na*-Kanäle 80
4.1.2 TRPV4 81
4.1.3 Nanchung und inactive 82
4.1.4 TRPML3 83
4.1.5 TRPP 83
4.1.6 TRPA1 84
4.1.7 TRPN1 als Modellsystem 86
4.2 Diskussion Ergebnisse 87
4.2.1 Yeast two hybrid 87
4.2.1.1 Falsch positive Ergebnisse 87
4.2.1.2 Ankyrin repeats als baits 89
4.2.1.3 Hefe-zwei-Hybrid-Screens 89
4.2.2 KolP 90
4.2.2.1 Auswahl einiger Proteine zur Immunpräzipitation 90
4.2.2.2 Ergebnisse der Ko-Immunpräzipitation 91
4.3 Schlussfolgerung und Ausblick 91
5. Zusammenfassung 93
6. Literaturverzeichnis 94
Danksagung 105
Lebenslauf 106
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