Klonierung und Charakterisierung des ersten equinen CLCA-Homologen, eCLCA1, und erste Untersuchungen zu seiner Bedeutung bei chronisch-obstruktiver Bronchiolitis des Pferdes:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Berlin
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2008
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| Beschreibung: | Nebentitel: Cloning and molecular characterization of the first equine CLCA homologue, eCLCA1, and first studies on its significance in equine chronic obstructive bronchiolitis |
| Beschreibung: | IX, 136 S. Ill., graph. Darst. 21 cm |
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I
INHALT
ABKUERZUNGEN************.********************.V
GLOSSAR AUSGEWAEHLTER MOLEKULARBIOLOGISCHER BEGRIFFE******.VII
1.
EINLEITUNG...................................................................................................................1
2. LITERATURUEBERSICHT
...............................................................................................3
2.1 A NIONENKANAELE
...............................................................................................................3
2.1.1 LIGANDEN-GESTEUERTE CHLORIDKANAELE
.........................................................3
2.1.2 CLC-KANALFAMILIE
.....................................................................................4
2.1.3 CYSTIC FIBROSIS TRANSMEMBRANE CONDUCTANCE REGULATOR
(CFTR)CHLORIDKANAL
.............................................................................................5
2.1.4 VOLUME REGULATED ANION CHANNEL (VRAC)
.............................................6
2.1.5 INTRAZELLULAERE CHLORIDKANAELE
(CLIC)..........................................................7
2.1.6 OUTWARDLY RECTIFYING CHLORIDE CHANNEL (ORCC)
.....................................7
2.1.7 KALZIUM-AKTIVIERTE
CHLORIDKANAELE..............................................................8
2.2 D IE CLCA-G ENFAMILIE
.....................................................................................................9
2.2.1 STRUKTUR DER CLCA-PROTEINE
...................................................................11
2.2.2 REGULATION DER CLCA-ASSOZIIERTEN CHLORIDLEITFAEHIGKEIT
..........................12
2.2.3 DIE
CLCA-FAMILIENMITGLIEDER.................................................................13
2.2.3.1 CLCA-VERTRETER DES
MENSCHEN..............................................................13
2.2.3.2 CLCA-VERTRETER DER MAUS
......................................................................14
2.2.3.3 CLCA-VERTRETER DES RINDES
...................................................................16
2.2.3.4 CLCA-VERTRETER DES SCHWEINES
.............................................................17
2.2.3.5 CLCA-VERTRETER DER RATTE
......................................................................17
2.3 M EDIZINISCHE B EDEUTUNG VON CLCA-P ROTEINEN
.........................................................18
2.3.1 CHLORIDKANAELE UND ZYSTISCHE FIBROSE
.....................................................18
2.3.2 CLCA-HOMOLOGE UND ASTHMA BRONCHIALE
..............................................19
2.4 C HRONISCH - OBSTRUKTIVE B RONCHIOLITIS DER P FERDE
..................................................21
2.4.1 BEGRIFFSBESTIMMUNG
...............................................................................21
2.4.2 PRAEVALENZ
...............................................................................................22
2.4.3 KLINIK
......................................................................................................22
2.4.4 AETIOLOGIE
.................................................................................................22
2.4.5
PATHOGENESE..........................................................................................23
2.4.6 PATHOLOGISCHES
BILD................................................................................24
IMAGE 2
I NHALT
II
3. ARBEITSHYPOTHESE, ZIELE UND
VERSUCHSPLANUNG.....................................26
4. MATERIAL UND
METHODEN......................................................................................28
4.1 U NTERSUCHUNGSMATERIAL UND P ROBENGEWINNUNG
.....................................................28
4.2 F ORMALINFIXIERUNG , P ARAFFINEINBETTUNG UND H ERSTELLUNG VON G
EWEBESCHNITTEN
.......................................................................................................................................29
4.3 P ROBENVORBEREITUNG FUER DIE MOLEKULARBIOLOGISCHEN U NTERSUCHUNGEN
..............29
4.3.1 ALLGEMEINE
HANDHABUNG........................................................................29
4.3.2 ISOLIERUNG DER
GESAMT-RNA...................................................................30
4.3.3 AUFREINIGUNG DER GESAMT-RNA
..............................................................30
4.3.4 GEWINNUNG DER POLY-A + -RNA
.................................................................31
4.3.5 REVERSE
TRANSKRIPTION............................................................................31
4.4 I DENTIFIZIERUNG EINER CLCA- C DNA-S EQUENZ BEIM P FERD
...........................................32
4.4.1
POLYMERASE-KETTENREAKTION....................................................................32
4.4.2
CDNA-PRAEZIPITATION.................................................................................34
4.4.3 GELEXTRAKTION UND AUFREINIGUNG DES
PCR-PRODUKTES.............................35
4.4.4 RACE (R APID AMPLIFICATION OF CDNA ENDS )
.............................................35
4.5 K LONIERUNG DER E CLCA1- C DNA
..................................................................................39
4.6 Q UANTITATIVE P OLYMERASE -K ETTENREAKTION ( Q PCR) IM REAL TIME -M
ODUS .................43
4.6.1 REFERENZFAKTOR ( HOUSEKEEPING- GEN) EF-1A
..........................................45
4.6.2 HERSTELLUNG DER
MENGENSTANDARDS.........................................................45
4.6.3 QUANTITATIVE POLYMERASE-KETTENREAKTION (QPCR) I: TAQMAN
-SONDEN....45
4.6.4 QUANTITATIVE POLYMERASE-KETTENREAKTION (QPCR) II: SYBR GREEN
..........48
4.6.5 QUANTIFIZIERUNG DER GENEXPRESSION
.......................................................50
4.7 M ORPHOMETRISCHE U NTERSUCHUNGEN
.........................................................................50
4.8 E RMITTLUNG DER E CLCA1-E XPRESSION PRO B ECHERZELLE
...........................................50
4.8.1 HAEMATOXYLIN-EOSIN-FAERBUNG FUER DIE
LASERMIKRODISSEKTION.....................51
4.8.2 FAERBUNG DER KRYOSTATSCHNITTE MITTELS
PAS-REAKTION..............................51
4.8.3 BESTIMMUNG DER BECHERZELLZAHL
............................................................52
4.8.4 LASERMIKRODISSEKTION UND RNA-ISOLATION
...............................................52
4.8.5 REVERSE TRANSKRIPTION MIT SUPERSKRIPT
III...............................................52
4.8.6 QUANTIFIZIERUNG DER ECLCA1 EXPRESSION PRO BECHERZELLE
.....................53
4.9 N ACHWEIS DER E CLCA 1- M RNA MITTELS N ORTHERN -B LOTING
.......................................54
4.10 N ACHWEIS DES E CLCA1-P ROTEINS MITTELS W ESTERN B LOT A NALYSE
...........................56
4.10.1 HERSTELLUNG EINES PROTEINLYSATES AUS
GESAMTGEWEBSPROBEN................56
4.10.2 SODIUM-DODECYL-SULFAT-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
....................57
4.10.3 WESTERNBLOTANALYSE
...............................................................................58
4.11 E CLCA1-P ROTEINNACHWEIS AM HISTOLOGISCHEN P RAEPARAT
.........................................59
IMAGE 3
I NHALT
III
4.11.1 HERSTELLUNG VON ANTIKOERPERN GEGEN ECLCA1
.........................................59
4.11.2 IMMUNHISTOCHEMISCHE FAERBUNG NACH DER AVIDIN-BIOTIN
PEROXIDASEKOMPLEX METHODE (ABC-METHODE)
........................................................60
5. ERGEBNISSE
...............................................................................................................62
5.1 I DENTIFIZIERUNG EINES EQUINEN CLCA-H OMOLOGEN
.....................................................62
5.2 S EQUENZIERUNG VON E
CLCA1.......................................................................................63
5.3 P HYLOGENETISCHE E INORDNUNG
....................................................................................66
5.4 B EURTEILUNG DER L UNGENGESUNDHEIT DER UNTERSUCHTEN P FERDE
............................67
5.5 E CLCA1-E XPRESSIONSMUSTER BEI GESUNDEN P FERDEN
...............................................68
5.5.1 QUANTITATIVE RT PCR: MRNA-NACHWEIS
................................................68
5.5.2 IMMUNHISTOCHEMISCHER NACHWEIS DES ECLCA1-PROTEINS IM GEWEBE ..70
5.6 E XPRESSION VON E CLCA1 BEI P FERDEN MIT COB
..........................................................76
5.6.1 QUANTIFIZIERUNG DER ECLCA1-MRNA-EXPRESSIONSHOEHEN
.......................76
5.6.2 IMMUNHISTOCHEMISCHER NACHWEIS DES ECLCA1-PROTEINS BEI COB
.......77
5.6.3 VERGLEICH DER ECLCA1-MRNA-MENGE IN COB-KRANKEN UND GESUNDEN
PFERDELUNGEN..........................................................................................78
5.6.4 VERGLEICH DER GROESSE DES ECLCA1-PROTEINS IN COB-KRANKEN UND
GESUNDEN
PFERDELUNGEN.........................................................................79
5.6.5 QUANTIFIZIERUNG DER BERCHERZELLHYPERPLASIE UND DER
ECLCA1EXPRIMIERENDEN ZELLEN
...........................................................................80
5.6.6 QUANTIFIZIERUNG DER ECLCA1-MRNA-KOPIENZAHLEN PRO BECHERZELLE
MITTELS LASERMIKRODISSEKTION UND QUANTITATIVER
RT-PCR........................84
6. DISKUSSION
................................................................................................................86
6.1 I DENTIFIZIERUNG UND C HARAKTERISIERUNG DES ERSTEN EQUINEN CLCA-V
ERTRETERS ..86
6.2 M ETHODISCHE A SPEKTE : M OEGLICHKEITEN UND G RENZEN DER E RMITTLUNG
DER M RNAK OPIENZAHLEN NACH L ASER -C APTURE -M ICRODISSECTION
..............................................93
7. ZUSAMMENFASSUNG
................................................................................................95
8. SUMMARY
....................................................................................................................97
9. LITERATURVERZEICHNIS
..........................................................................................99
10.
ANHANG.....................................................................................................................113
10.1 U NTERSUCHTE P FERDE
.................................................................................................113
10.2 R EAGENZIEN , L OESUNGEN UND P ROTOKOLLE FUER F ORMALINFIXIERUNG ,
P ARAFFINEINBETTUNG UND F AERBUNGEN
........................................................................116
10.3 R EAGENZIEN , L OESUNGEN UND P UFFER FUER DIE IMMUNHISTOCHEMISCHEN A
RBEITEN ......118
IMAGE 4
I NHALT
IV
10.4 R EAGENZIEN , L OESUNGEN , P UFFER UND W ASSER FUER DIE
MOLEKULARBIOLOGISCHEN
A RBEITEN
.....................................................................................................................119
10.4.1 REAGENZIEN UND KITS FUER DIE RNA-ISOLIERUNG
.......................................119
10.4.2 REAGENZIEN UND PROTOKOLLE FUER DIE NORTHERN BLOT
HYBRIDISIERUNG.........120
10.4.3 REAGENZIEN UND PROTOKOLLE FUER DIE WESTERN BLOT ANALYSE
...................122
10.5 O RGANISCHE L OESUNGSMITTEL
......................................................................................124
10.6 G ERAETE UND V ERBRAUCHSMATERIALIEN
.......................................................................124
10.7 E RGEBNISSE ZU DEN M OLEKULARBIOLOGISCHEN U NTERSUCHUNGEN (R
OHDATEN ).........125
11. EIDESSTATTLICHE ERKLAERUNG
...........................................................................135
12. DANKSAGUNG
..........................................................................................................136
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