Analyse der differentiellen mRNS-Expression in respiratorischen Epithelzellen nach Stimulation mit Streptococcus pyogenes: differentielle Expression des NOD1-Gens
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Autor: Schmidt, Kristina
Jahr: 2008
- VIII -
INHALTSVERZEICHNIS
1 Einleitung 1
2 Fragestellung 5
3 Material und Methoden 6
3.1 Zellkulturen 6
3.1.1 Kultivierung der A-549-Zeil-Linie 6
3.1.2 SubkultivierungderA549-Zell-Linie 8
3.1.3 Kultivierung von Streptococcus pyogenes 8
3.1.4 Stimulationsversuche an Zellkulturen 9
3.2 Isolierung der Gesamtzell-RNS 10
3.3 Photometrische Quantitätsbestimmung der RNS-
Konzentration 11
3.4 Qualitative Kontrolle der RNS mittels Agarose-
Gelelektrophorese 11
3.5 Reverse Transkription der mRNS 12
3.6 Differential Display Reverse Transcription- Polymerase
Chain Reaction (DDRT-PCR) 13
3.6.1 PCR mit radioaktiv markiertem Isotop 14
3.6.2 Aufbereitung der PCR-Produkte 15
3.6.3 Polyacrylamid-Gelelektrophorese 15
3.6.4 Autoradiographie der elektrophoretisch aufgetrennten Proben .. 16
3.6.5 Vergleich der Bandenmuster und Isolierung differentiell
exprimierter Fragmente aus dem Gel 16
-IX-
3.7 Extraktion der differentiell exprimierten cDNS-Fragmente .... 16
3.8 Reamplifikation der differentiell exprimierten Fragmente 17
3.8.1 Aufbereitung der PCR-Produkte 17
3.9 Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Silbernitratfärbung.... 18
3.10 Klonierungsreaktion 19
3.10.1 Ligation 20
3.10.2 Transformation des Ligationskomplexes in kompetente Zellen . 20
3.10.3 Anzüchten der Bakterien und Selektion von Klon 20
3.10.4 Plasmidextraktion 21
3.10.5 Kontrolle der Insert-DNS durch Restriktionsanalyse 22
3.10.6 Sequenzierung der Fragmente und Datenbankvergleich 23
4 Ergebnisse 24
4.1 Vergleichende Analyse des mRNS-Expressionsmusters 24
4.2 Reamplifikation des differentiell exprimierten Fragmentes .... 25
4.3 Klonierung des differentiell exprimierten Fragmentes
und Transformation des Vektors in kompetente Zellen 26
4.4 Selektion der Klone und Restriktionsanalyse 27
4.5 Sequenzanalyse und Datenbankvergleich 28
5 Diskussion 30
5.1 Das angeborene Immunsystem 30
5.2 Rezeptoren des angeborenen Immunsystems 31
5.2.1 DerToll-Like-Rezeptor(TLR) 31
5.2.2 Nucleotide-Binding-Oligomerisation-Domain (NOD) 32
5.3 Signalkaskade nach NOD 1 -Aktivierung 34
5.3.1 Aktivierung von Proteinen 34
5.3.2 Auswirkungen der Immunantwort 38
-X-
5.4 Wie kommt es zu einer Expression von NOD1 nach
einer Stimulation mit grampositiven Bakterien? 41
5.5 Relevanz für die Klinik 44
5.5.1 Erkrankungen durch Defekte im NOD1-Gen 44
5.5.2 Auswirkung von NOD1-Gendefekten auf Tumorerkrankung .... 45
5.6 Schlussfolgerung 46
6 Zusammenfassung 48
7 Literaturverzeichnis 50
8 Danksagung 60
9 Lebenslauf 61
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