Histochemische und immunhistochemische Charakterisierung der Transgenexpression in der Netzhaut transgener Mauslinien:
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| adam_text | Titel: Histochemische und immunhistochemische Charakterisierung der Transgenexpression in der Netzhaut tran
Autor: List, Jonathan
Jahr: 2009
INHALTSVERZEICHNIS
1. Einleitung 5
1.1 Gliazellen 5
1.2 Pathologische Reaktionen von Gliazellen im ZNS 6
1.3 Das Auge 7
1.4 Die Retina, orientierende Anatomie und Physiologie 8
1.5 Die Müllersche Gliazelle (Müllerzelle) 10
1.5.1 Aufbau und Funktionen 10
1.5.2 Reaktionen der Müllerzellen auf Schädigungen der Retina 13
1.6 Labormausstämme 14
1.7 Markierung von Zellen durch transgene Expression von Reportergenen 15
1.8 Fluoreszierende Proteine, eine Übersicht 20
1.9 Markierung von makroglialen Zellen der Retina durch transgene Expression von
Reportergenen 21
2. Aufgabenstellung 23
3. Material und Methoden 24
3.1 Die untersuchten Mauslinien 24
3.1.1 Transgene Mauslinien mit hGFAP-gekoppeltem Fluoreszenzprotein 24
3.1.2 Transgene Mauslinien mit Expression der tamoxifeninduzierbaren
Variante der Cre-Rekombinase (CreERT2) unter der Aktivität des
hGFAP-Promotors 25
3.1.3 Transgene Mauslinien mit Expression der tamoxifeninduzierbaren
Variante der Cre-Rekombinase (CreERT2) unter der Aktivität des
GLAST-Promotors 26
3.2 Präparation der Retinae 28
3.3 Färbungen 29
3.3.1 Immunhistochemische Färbungen 29
1
3.3.1.1 Standardprotokoll der Immunfluoreszenzhistochemie für
Retinaschnitte 30
3.3.1.2 Standardprotokoll der DAB-Immunhistochemie für
Gefrierschnitte 31
3.3.1.3 Verwendete Primärantikörper 32
3.3.1.4 Verwendete Sekundärantikörper für die Immunfluoreszenz-
Histochemie 32
3.3.1.5 Verwendete Farbstoffe zur unspezifischen Kernfärbung 33
3.3.2 Histochemische Färbungen 33
3.3.2.1 X-Phos-Färbung zum Nachweis von humaner plazentarer
alkalischer Phosphatase (PLAP) 33
3.3.2.2 LacZ-Färbung zum Nachweis der ß-Galaktosidase 35
3.3.3 Zellfärbung von Frischpräparaten mit dem Vitalfarbstoff Mitotracker
Orange® 36
3.4 Mikroskopie 36
3.4.1 Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (cLSM) 36
3.4.2 Lichtmikroskopie 37
3.4.3 Stereomikroskopie 37
3.4.4 Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie (2-Phot-LSM) 38
4. Ergebnisse 39
4.1 Mäuse mit transgener Expression fluoreszenter Proteine 39
4.1.1 Verbessertes grün fluoreszierendes Protein (EGFP) 39
4.1.1.1 Linie TgN(hGFAP-EGFP)-GFEA (FKI) 39
4.1.1.2 Linie TgN(hGFAP-EGFP)-GFEC (FKI) 42
4.1.1.3 Linie TgN(hGFAP-EGFP)-GFEC-C57/B6 (FKI) 44
4.1.2 Verbessertes cyanblau fluoreszierendes Protein (ECFP) 46
4.1.2.1 Linie TgN(hGFAP-ECFP)-GCFD-FVB/N (FKI) 46
4.1.2.2 Linie TgN(hGFAP-ECFP)-GCFD-C57/B6 (FKI) 48
4.1.3 Monomerisches rot fluoreszierendes Protein (mRFPl) 48
2
4.1.3.1 Linie TgN(hGFAP-mRFP 1 )-GRFU (FKI) 48
4.1.3.2 Linie TgN(hGFAP-mRFPl)-GRFT (FKI) 49
4.1.4 AmCyanl: Linie TgN(hGFAP-AmCyan 1 )-GCYM (FKI) 49
4.2 Transgene Mauslinien mit CreERT2-Expression 50
4.2.1 Mauslinien mit CreERT2-Expression unter der Aktivität des humanen
GF AP-Promotors 50
4.2.1.1 Mit Reporterlinie ROSB (LacZ)gekreuzte Maus der hGF AP-
CreERT2-Linie:TgN(hGFAP-CreERT2)xROAS26-STOPflox-
LacZ(FKI) 50
4.2.1.2 Mit der Reporterlinie ROSY (EYFP) gekreuzte Maus der hGFAP-
CreERT2-Linie:TgN(hGFAP-CreERT2)xROSA26-STOPflox-
EYFP(FKI) 52
4.2.2 Mauslinien mit CreERT2-Expression unter der Aktivität eines GLAST-
Promotors 53
4.2.2.1 Mit der Reporterlinie Z/AP gekreuzte Mauslinien der GLAST-
CreERT2-Linie 53
4.2.2.2 Mit der Reporterlinie Z/EG gekreuzte Mauslinien der GLAST-
CreERT2-transgenen Mäuse 58
4.2.2.3 Mit der Reporterlinie LacZ gekreuzte Mauslinien der GLAST-
CreERT2-transgenen Mäuse 59
5. Diskussion 62
5.1 Material- und Methodendiskussion 62
5.2 Ergebnisdiskussion 65
5.2.1 Transgene Mauslinien mit epifluoreszenter Transgenexpression 65
5.2.2 Transgene Mauslinien mit CreERT2-Expression in glialen Zellen 71
5.2.2.1 CreERT2-Expression unter der Kontrolle eines hGFAP-
Promotors 73
5.2.2.2 CreERT2-Expression unter der Kontrolle eines GLAST-
Promotors 74
5.3 Notwendige weiterführende Untersuchungen an den transgenen Mäusen 75
3
5.4 hGFAP: ein menschlicher Promotor wird in das Mäusegenom integriert 76
5.5 Aktuelle weiterführende Versuche mit den vorgestellten Mauslinien 77
5.6 Ein Ausblick, oder große Ziele mit kleinen Nagern 77
6. Zusammenfassung 80
7. Literaturverzeichnis 83
8. Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit
9. Danksagung
10. Lebenslauf
4
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