Kombination von Strahlentherapie und anti-angiogener Therapie durch mTOR-Blockade in vitro und in vivo:
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Autor: Paringer, Carmen
Jahr: 2009
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
Inhaltsverzeichnis......................................................................................................I
Abkürzungen............................................................................................................IV
I. Einleitung.............................................................................................................1
1. Angiogenese..........................................................................................................2
1.1 Physiologische Grundlagen der Angiogenese..................................................2
1.2 Angiogenese und Tumorwachstum..................................................................3
1.3 Aktuelle Studienlage.........................................................................................4
2. Anti-angiogene Therapie durch mTOR-lnhibition...................................................5
3. Strahlentherapie und Angiogenese........................................................................6
4. mTOR-abhängige Strahlenresistenz......................................................................6
6. Zielsetzung.............................................................................................................8
II. Material und Methoden......................................................................................10
1. Zelllinien und Zellkultur........................................................................................10
1.1 Humanes Pankreaskarziom L3.6pl...............................................................10
1.2 Murines Kolonkarzinom CT-26.......................................................................10
1.3 Murines Fibrosarkom BFS-1...........................................................................10
1.4 Endothelzellen humaner Nabelschnurvenen (HUVEC)..................................10
1.5 Zellkultur.........................................................................................................11
1.5.1 Kulturmedien der Tumorzellen................................................................11
1.5.2 Kulturmedium der Endothelzellen...........................................................11
1.5.3 Kultur der Tumor- und Endothelzellen....................................................11
2. mTOR-lnhibitor RAD001 (Everolimus).................................................................12
3. Experimente in vitro.............................................................................................13
3.1 WST-1 Proliferationsassay.............................................................................13
3.2 Bestimmung der bestrahlungsabhängigen VEGF-Sekretion der
Tumorzellen....................................................................................................15
3.2.1 Zellkultur und Behandlung der Zellen.....................................................15
3.2.2 Quantitative VEGF-Bestimmung.............................................................15
3.2.3 Proteinbestimmung.................................................................................16
3.3 Spheroidassay................................................................................................16
3.4 Bestimmung der Aktivierung des mTOR-Signalweges anhand der
Phosphorylierung des ribosomalen S6 Proteins.............................................17
3.4.1 Antikörper...............................................................................................18
3.4.2 Negativkontrollen....................................................................................18
3.4.3 Immunzytochemie..................................................................................18
3.4.3.1 Kultivieren der Zellen auf Objektträgern.........................................18
3.4.3.2 Immunzytochemische Analyse des ribosomalen S6 Proteins
anhand der Biotin/ Streptavidin-Methode (FITC= fluoreszierendes
Isothiocyanat).................................................................................19
4. Experimente in vivo..............................................................................................20
4.1 Versuchstiere..................................................................................................20
4.2 Vorbereitung der Tumorzellen zur Implantation..............................................21
Inhaltsverzeichnis
4.3 Implantation der Tumorzellen.........................................................................21
4.3.1 Anästhesie der Tiere..............................................................................21
4.3.2 Subkutane Implantation der Tumorzellen BFS-1 und CT-26..................21
4.3.3 Orthotope Implantation der Tumorzellen L3.6pl......................................22
4.4 Dokumentation des Tumorwachstums............................................................23
4.4.1 Subkutan wachsende Tumoren..............................................................23
4.4.2 Orthotop wachsende Tumoren...............................................................23
4.4.3 Wiegen der Tiere....................................................................................23
4.5 Tierexperimentelles Studiendesign.................................................................24
4.5.1 Bestrahlung der Tumoren in vivo............................................................26
4.5.1.1 Orthotopes Pankreas-Tumormodell................................................27
4.5.1.2 Subkutanes Tumormodell...............................................................27
4.6. Bestimmung des RAD001 Serumspiegels......................................................27
4.7 Immunhistochemie..........................................................................................28
4.7.1 Negativkontrollen....................................................................................28
4.7.2 Ribosomales S6 Protein.........................................................................28
4.7.2.1 Verwendete Antikörper...................................................................28
4.7.2.2 Pankreaskarziom L3.6pl...............................................................28
4.7.2.3 Fibrosarkom BFS-1........................................................................29
4.7.3 Analyse der Mikrogefäßdichte des humanen Pankreaskarziom L3.6pl 30
5. Darstellung der Ergebnisse und statistische Bewertung......................................31
III. Ergebnisse..........................................................................................................32
1. Experimente in vitro.............................................................................................32
1.1 Proliferationsassay.........................................................................................32
1.1.1 Humanes Pankreaskarziom L3.6pl.......................................................32
1.1.2 Murines Fibrosarkom BFS-1...................................................................33
1.1.3 Murines Kolonkarzinom CT-26...............................................................36
1.1.4 Endothelzellen humaner Nabelschnurvenen (HUVECs)........................39
1.2 Quantitative VEGF-Bestimmung.....................................................................42
1.2.1 Humanes Pankreaskarziom L3.6pl.......................................................4^
1.2.3 Murines Fibrosarkom BFS-1...................................................................44
1.2.2 Murines Kolonkarzinom CT-26...............................................................46
1.3 Speroidassay..................................................................................................47
1.4 Analyse des PI3K/Akt/mTOR-Signalweges anhand des phosphorylierten
ribosomalen S6 Proteins................................................................................. ^
1.4.1 Humanes Pankreaskarziom L3.6pl.......................................................4^
1.4.2 Murines Fibrosarkom BFS-1...................................................................~°
1.4.3 Murines Kolonkarzinom CT-26...............................................................fl
1.4.4 Endothelzellen humaner Nabelschnurvenen (HUVECs)........................=2
2. Experimente in vivo..............................................................................................
2.1 Orthotopes Pankreaskarziom L3.6pl.............................................................fi
2.2 Orthotopes Fibrosarkom BFS-1......................................................................?
2.3 Subkutanes Kolonkarzinom CT-26.................................................................?L
2.4 Bestimmung des RAD001-Serumspiegels......................................................
2.5 Immunhistochemische Analyse des PI3K/Akt/mTOR-Signalweges
anhand der Phosphorylierung des ribosomalen S6 Proteins..........................jL
2.5.1 Humanes Pankreaskarziom L3.6pl (FITC)............................................~
2.5.2 Murines Fibrosarkom BFS-1 (DAB)........................................................°
II
Inhaltsverzeichnis
2.6 Immunhistochemische Analyse der Mikrogefäßdichte im humanen
Pankreaskarziom L3.6pl...............................................................................61
IV. Diskussion...........................................................................................................62
1. Diskussion der Methodik......................................................................................62
1.1 Tumorzelllinien...............................................................................................62
1.1.1 Humanes Pankreaskarziom L3.6pl.......................................................62
1.1.2 Murines Fibrosarkom BFS-1...................................................................64
1.1.3 Murines Kolonkarzinom CT-26...............................................................64
1.2 mTOR-lnhibitor RAD001 (Everolimus)............................................................65
1.2.1 Rapamycin: Herkunft und Ursprung.......................................................65
1.2.2 RAD001 (Everolimus)............................................................................65
1.2.2.1 Applikation von RAD001.................................................................66
1.3 Orthotopes versus subkutanes Tumormodell.................................................67
1.3.1 Vor- und Nachteile in Bezug auf die Strahlentherapie............................68
1.4 Messung des subkutanen und orthotopen Tumorwachstums.........................68
1.5 WST-1 Proliferationsassay.............................................................................69
1.6 Spheroidassay................................................................................................70
1.7 Aktivierung/ Inaktivierung des mTOR-Signalweges mittels
Immunfluoreszenz des ribosomalen S6 Proteins............................................70
2. Diskussion der Ergebnisse...................................................................................71
2.1 mTOR-lnhibition und anti-angiogene Therapie...............................................71
2.1.1 ?Normalizing effect der anti-angiogenen Therapie.................................73
2.1.2 Verhinderung der Repopularisierung von Tumorzellen unter anti-
angiogener Therapie..............................................................................75
2.1.3 Hemmung der Rekrutierung von endothelialen Voriäuferzellen..............76
2.2 Stimulation der Tumorangiogenese als Streßantwort auf die
Strahlentherapie.............................................................................................77
2.3 Stellenwert des mammalian Target of Rapamycin (mTOR) in der
Strahlenresistenz............................................................................................78
2.4 Einfluss von mTOR-lnhibition und Bestrahlung auf die Proliferation von
Tumor- und Endothelzellen in vitro.................................................................82
2.5 Beurteilung der Stressantwort der Tumorzellen auf die Bestrahlung
alleine und unter mTOR-Blockade..................................................................86
2.6 Anti-angiogene Wirksamkeit von Bestrahlung und mTOR-lnhibition..............88
2.7 Aktivierung des PI3K/Akt/mTOR-Signalweges unter Bestrahlung -
Signalweg der strahleninduzierten Stressantwort in Tumorzellen und
Endothelzellen................................................................................................88
2.7.1 Immunzytochemische Untersuchungen der Tumor- und Endothelzellen88
2.8 Experimente in vivo........................................................................................90
V. Zusammenfassung..............................................................................................94
VI. Schlussfolgerung.............................................................................................98
Literaturverzeichnis...............................................................................................99
Danksagung............................................................................................................120
CURRICULUM VlTAE...................................................................................................122
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