Funktionelle und genomische Charakterisierung von humanen aus Monozyten generierten dendritischen Zellen:
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2008
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| adam_text | Titel: Funktionelle und genomische Charakterisierung von humanen aus Monozyten generierten dendritischen Ze
Autor: Bringmann, Anita
Jahr: 2008
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis I
Abkürzungsverzeichnis i
I.Einleitung 1
1.1 Dendritische Zellen 1
1.1.1 Überblick 1
1.1.2 Subpopulationen dendritischer Zellen 1
1.1.3 Funktionelle Stadien von dendritischen Zellen 3
1.1.3.1 Unreife dendritische Zellen 3
1.1.3.2 Reife dendritische Zellen 4
1.1.3.3 In Wfro-Generierung von dendritischen Zellen 6
1.2 Tolllike Rezeptoren (TLR) 6
1.2.1 Überblick 6
1.2.2 Toll like Rezeptor 4 (TLR4) 8
1.3 Zoledronsäure 9
1.4 Noxin 12
1.5 Zielsetzung 12
1.5.1 Zielsetzung des Themas „Einfluss von Zoledronat auf die Generierung
und Funktion dendritischer Zellen 12
1.5.2 Zielsetzung des Themas „Charakterisierung des differentiell in mDC
exprimierten Gens p306 13
2. Material 15
2.1 Geräte 15
2.2 Verbrauchsmaterialien 16
2.3 Chemikalien 16
2.4 Reagenzien für die Zellkultur 17
2.5 Produkte für die magnetische Zellsortierung 18
2.6 Reagenzien für die Molekularbiologie 18
2.7 Oligodesoxyribonukleotide 19
2.8 Reaktionskits für die Bearbeitung von Nukleinsäuren 19
2.9 Bakterienstämme 19
2.10 Reagenzien für die Proteinbiochemie 20
2.11 Antikörper 21
I
2.11.1 Antikörper für Western Blot Analysen 21
2.11.1.1 Unkonjugierte Antikörper 21
2.11.1.2 Konjugierte Zweitantikörper 21
2.11.2 Antikörper für die Durchflusszytometrie 22
2.11.3 Antikörper für die Zellkultur 22
2.12 Puffer und Stammlösungen 23
3. Methoden 27
3.1 Zellkultur 27
3.1.1 Kultivierung von Zellen 27
3.1.2 Bestimmung der Lebendzellzahl 27
3.1.3 Kryokonservierung von Zellen 27
3.1.4 Gewinnung mononukleärer Zellen 28
3.1.5 Generierung von dendritischen Zellen aus Monozyten 28
3.1.6 Variationen in der Generierung von dendritischen Zellen 29
3.1.7 Generierung von Makrophagen aus Monozyten 29
3.1.8 Isolierung verschiedener Zellpopulationen durch magnetische
Zellsortierung (MACS) 30
3.1.9 Isolierung von Granulozyten 30
3.1.10 Durchflusszytometrie 31
3.1.11 Migration 32
3.1.12 Mixed Lymphocyte Reaction (MLR) 32
3.1.13 Analyse der Zytokinsekretion 33
3.1.14 Induktion von Antigen-spezifischen CTL-Antworten 33
3.1.15 Chrom [51Cr]-Release-Assay 34
3.2 Proteinbiochemische Methoden 35
3.2.1 Zelllyse und Proteinextraktion 35
3.2.2 Isolierung von Nuclei und Proteinextraktion 35
3.2.3 Proteinkonzentrationsbestimmung 35
3.2.4 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) 36
3.2.5 Coomassie-Färbung von Polyacrylamidgelen 38
3.2.6 Western Blot Analyse 38
3.2.7 Stripping von Nitrozellulose-Membranen 40
3.3 Molekularbiologische Methoden 41
3.3.1 Isolierung von RNA mit Anionenaustauschsäulen 41
II
3.3.2 Konzentrationsbestimmung von RNA 41
3.3.3 Polymerasekettenreaktion (PCR) 41
3.3.3.1 Generierung von cDNAaus Gesamtzell-RNA 42
3.3.3.2 PCR 42
3.3.4 Kultivierung von E.coli 43
3.3.5 Transformation von E.coli 44
3.3.6 Isolierung von Plasmid-DNA aus E.coli 44
3.3.7 Konzentrationsbestimmung von DNA 45
3.3.8 Restriktionsverdau von DNA 45
3.3.9 Agarosegel-Elektrophorese 45
3.3.10 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 46
3.3.11 Anhängen von 3 A-Überhängen 46
3.3.12 Phenol-Chloroform-Extraktion von DNA 46
3.3.13 DNA-Fällung mit Ammoniumacetat 47
3.3.14 Ligation von DNA 47
3.3.15 Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) 47
3.3.15.1 Generierung einer doppelsträngigen cDNA-Bibliothek aus
Gesamtzell-RNA 48
3.3.15.1.1 Erststrang cDNA-Synthese 48
3.3.15.1.2 Zweitstrang cDNA-Synthese 48
3.3.15.2 Adaptor-Ligation 48
3.3.15.3 Verdünnung der Adaptor-Iigierten cDNA 49
3.3.15.4 RACE 49
3.3.16 Sequenzierung 50
4. Vorarbeiten 51
4.1 Generierung einer subtraktiven cDNA-Bibliothek 51
4.1.1 Hintergrundinformation 51
4.1.2 Experimenteller Ansatz 51
4.2 Identifizierung der Sequenz des Gens p306 52
4.3 Generierung eines polyklonalen Kaninchenserums gegen P306.a und
P306.b 52
Einfluss von Zoledronat auf die Generierung und Funktion von mDC 53
5. Ergebnisse 53
5.1 Herstellung dendritischer Zellen aus Monozyten 53
III
I
5.2 Behandlung mit Zoledronsäure 54
5.3 Migrationsverhalten 56
5.4 Zytokinsekretion 56
5.5 Stimulierung von allogenen T-Lymphozyten 57
5.6 Induktion primärer CTL-Antworten 58
5.7 Induktion von Apoptose 59
5.8 Effekte auf intrazelluläre Signalkaskaden 60
6. Diskussion 62
7. Zusammenfassung 66
Charakterisierung des differentiell in mDC exprimierten Gens p306 68
8. Ergebnisse 68
8.1 Ergebnisse der Datenbank-Recherche 68
8.2 Überprüfung der Nukleotidsequenz von p306 68
8.3 Verifikation des differentiellen Spleißprozesses 69
8.4 p306-Expression in DC-Populationen des peripheren Blutes 71
8.5 p306-Expression in hämatopoetischen Zellen 71
8.6 Strukturvorhersage der P306-Proteine 73
8.7 Nachweis der P306-Proteinexpression 75
8.9 Regulierung der Expression und Kernlokalisation von p306 77
8.10 Inhibition der N-Glykosylierung 78
9. Diskussion 80
10. Zusammenfassung 85
11. Literatur 87
12. Danksagung 99
13. Liste der akademischen Lehrer 101
14. Lebenslauf 102
15. Publikationsliste 104
IV
|
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