Regulation podosomaler Adhäsionen in primären humanen Makrophagen durch p21-activated kinase (PAK)-abhängige Signalwege:
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| adam_text | Titel: Regulation podosomaler Adhäsionen in primären humanen Makrophagen durch p21-activated-kinase-, (PA
Autor: Gringel, Alexandra
Jahr: 2009
7
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG 13
1.1 Makrophagen 13
1.2 Zytoskelett 15
1.2.1 Aktinzytoskelett 16
1.2.1.1 Aktindynamik 16
1.2.1.2 Dendritic Nucleation Modell 17
1.2.1.3 Regulation durch RhoGTPasen 19
1.2.2 Podosomen 21
1.2.2.1 Aufbau 22
1.2.2.2 Podosomenbildung und-dynamik 23
1.2.2.3 Podosomen-Regulation 24
1.2.2.4 Funktion 25
1.3 ADF/Cofllin 26
1.3.1 Funktion 26
1.3.2 Regulation 28
1.4 PAK (p21-activated Klnase) 31
1.4.1 Allgemeines 31
1.4.2 Aufbau 33
1.4.3 Regulation 34
1.4.3.1 Autoinhibition 34
1.4.3.2 GTPase-abhängige Regulation 35
1.4.3.3 GTPase-unabhängige Regulation 35
1.4.4 PAK1 und PAK4 im Vergleich 36
1.4.5 Funktion 37
1.5 PIX (P AK-Zmeracf/ve exchange factoi) 40
1.5.1 Allgemeines 40
1.5.2 Aufbau 40
1.5.3 Funktion 42
1.6 GIT (G protein-coupled receptor kinase interactor) 43
1.7 PAK-PIX Interaktion und PAK-PIX-GIT Komplex 44
1.8 Medizinische Relevanz podosomaler Strukturen und Ihrer Regulatoren In Makrophagen.. 45
1.9 Fragestellung 48
2 MATERIAL UND METHODEN 50
2.1 Zellbiologische Methoden 50
2.1.1 Arbeiten mit E co// 50
Allgemeines 50
Kultivierung von E. coli 50
2.1.2 Transformation von Plasmiden 51
2.1.2.1 Herstellung elektrokompetenter Eco/i DH5o 51
2.1.2.2 Transformation mittels Elektroporation 51
2.1.2.3 Herstellung hitzekompetenter Bakterien 51
2.1.2.4 Hitzeschocktransformation 52
2.1.3 Arbeiten mit primären menschlichen Zellen 52
2.1.3.1 Allgemeines 52
2.1.3.2 Isolation primärer humaner Makrophagen aus menschlichem Blut 52
8
2.1.3.3 Isolierung menschlicher Endothelzellen aus der Nabelschnur 54
2.1.4 Ablösung adhärenter Zellen 55
2.1.5 Transfektion von Zellen 55
2.2 Molekularbiologische Methoden 55
2.2.1 DNA-Präparation 55
2.2.1.1 Plasmide 55
2.2.1.2 Agarosegelelektrophorese 56
2.2.1.3 Plasmidisolierung 57
2.2.1.4 Gelelution 57
2.2.2 DNA Restriktionsverdau 57
2.2.2.1 analytisch 57
2.2.2.3 präparativ 57
2.2.3 Ligation 57
2.2.3.1 Allgemein 57
2.2.3.2 Präparation des Zielvektors 58
2.2.3.3 Präparation der DNA Fragmente 58
2.2.3.4 Klonierung mit Hilfe synthetischer Oligonukleotide 59
2.2.3.5 Ligation 60
2.2.3.5 Transformation in Zellen 61
2.2.3.6 Bakterien-PCR (Kolonie-PCR) 61
2.2.4 RNA-Interferenz (RNAi) 61
2.2.5 DNA micro array 63
2.3 Proteinbiochemische Methoden 63
2.3.1 Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen 63
2.3.2 Western Blot 63
2.3.2.1 Puffer und Lösungen 63
2.3.2.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 65
2.3.2.3 Blotting 65
2.3.2.4 Detektion 65
2.3.2.5 Molekulargewichtsbestimmung 66
2.3.3 Interaktionsstudien 66
2.3.3.1 Vorbemerkung 66
2.3.3.2 Herstellung von Zelllysaten aus humanen Zellen 66
2.3.3.3 Differentielle Lyse 66
2.3.3.4 Immunpräzipitation 67
2.4 Immunfluoreszenz und Mikroskopie 68
2.4.1 Indirekte Immunfluoreszenz 68
2.4.1.1 Fixierung und Lyse von Zellen 68
2.4.1.2 Färbung mit spezifischen Antikörpern 69
2.4.2 Fluoreszenzmikroskopie und Bildverarbeitung 70
3 ERGEBNISSE 71
3.1 Zielsetzung der Arbeit 71
3.2 Bedeutung von Cofilin für die Podosomen-Regulation 71
3.2.1 Auswirkungen der Cotilin-Überexpression aut primäre humane Makrophagen 72
3.2.2 Überexpression von Cofilin-Mutanten und deren Auswirkungen auf primäre humane
Makrophagen 72
3.3 Bedeutung von PAK für die Podosomen-Bildung 76
3.3.1 PAK4 als physiologischer Podosomen-Regulator in primären humanen Makrophagen 76
3.3.2 Transfektion mit PAK4 shRNA führt zu einer Verminderung der Podosomenanzahl 79
3.3.3 Überexpression von PAK4 in primären humanen Makrophagen 82
3.3.4 Überexpression von PAK4-Mutanten in primären humanen Makrophagen 84
3.3.5 Einfluß der PAK4 Kinase Domäne auf die Podosomen-Bildung 88
9
3.4 Bedeutung von aPIX für die Podosomen-Bildung 92
3.4.1 aPIX Lokalisation in primären humanen Makrophagen 92
3.4.2 aPIX Überexpression in primären humanen Makrophagen 93
3.4.3 Überexpression von oPIX-Mutanten in primären humanen Makrophagen 95
3.5 GIT1 102
3.6 PAK4-aPIX Interaktionsstudien 103
4 DISKUSSION 105
4.1 Bedeutung von Cofilin für die Podosomen-Regulation 105
4.2 Bedeutung von PAK4 für die Podosomen-Bildung 105
4.3 Bedeutung von a-PIX für die Podosomen-Bildung 105
4.4 GIT1 105
4.5 Interaktionsstudien 105
4.5.1 PAK4-O-PIX Interaktion 105
4.5.2 x-PIX-GIT1 Interaktion 105
4.5.3 PAK4-GIT1 Interaktion 105
4.6 Modell der Podosomenregulation in Makrophagen 105
5 AUSBLICK 105
6 ZUSAMMENFASSUNG 105
7 LITERATUR 105
8 DANKSAGUNG 105
9 LEBENSLAUF 105
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