PCR-gestützte Konstruktion von cDNA-Banken aus kleinsten Mengen von Dictyocaulus-viviparus-Larven:
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1995
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1
EINLEITUNG
.
9
2
LITERATURUEBERSICHT
.
12
2.1
DIE
DIKTYOKAULOSE
DES
RINDES
.
12
2.1.1
ERREGER
.
12
2.1.2
VORKOMMEN
UND
WIRTSCHAFTLICHE
BEDEUTUNG
.
12
2.1.3
BIOLOGIE
.
13
2.1.4
ENTWICKLUNG
.
14
2.1.5
KLINIK
UND
PATHOGENESE
.
15
2.1.6
IMMUNITAET
.
16
2.1.7
ENZYME
UND
ANTIGENE
VON
DICTYOCAULUS
VIVIPARUS
.
18
2.1.8
DIAGNOSE
.
21
2.1.9
BEKAEMPFUNG
.
24
2.1.9.1
WEIDETECHNISCHE
MASSNAHMEN
.
24
2.1.9.2
ANTHELMINTHIKA
.
26
2.1.9.3
VAKZINIERUNG
.
27
2.2
IN
VITRO
KULTIVIERUNG
.
28
2.2.1
EINFUEHRUNG
.
28
2.2.2
VERFAHREN
ZUR
ENTSCHEIDUNG
PARASITAERER
NEMATODEN
.
29
2.2.2.1
ABLAUF
DER
ENTSCHEIDUNG
.
30
2.2.3
MORPHOLOGIE
DER
PARASITISCHEN
LARVENSTADIEN
VON
DICTYOCAULUS
VIVIPARUS
.
31
2.2.4
VERFAHREN
ZUR
IN
VITRO
KULTIVIERUNG
PARASITAERER
NEMATODEN
.
31
2.3
RNA-ISOLIERUNG
AUS
HELMINTHEN
.
32
2.3.1
DEGRADATION
DER
AEUSSEREN
UND
INNEREN
MEMBRANEN
.
32
2.3.2
RNA-ISOLIERUNG
.
32
2.4
AMPLIFIKATION
KOMPLEMENTAERER
DNA
(CDNA)
.
34
2.4.1
RAPID
AMPLIFICATION
OF
CDNA
(RACE)
.
35
2.4.2
UNSPEZIFISCHE
CDNA-PCR
.
36
2.5
REKOMBINANTE
ANTIGENE
.
37
2.5.1
DIAGNOSE
VON
HELMINTHOSEN
MITTELS
REKOMBINANTER
ANTIGENE
.
37
2.5.2
REKOMBINANTE
VAKZINEN
GEGEN
HELMINTHENINFEKTIONEN
.
40
3
EIGENE
UNTERSUCHUNGEN
.
42
3.1
MATERIAL
UND
METHODEN
.
42
3.1.1
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
42
3.1.2
MEDIEN
UND
PLATTEN
.
43
3.1.3
REAGENTIEN,
ENZYME,
REAKTIONSGEFAESSE,
REAKTIONSKITS
UND
GERAETE
.
43
3.1.4
BAKTERIEN
UND
VEKTOREN
.
46
3.1.5
VERSUCHSPLAN
.
46
3.1.6
ENTSCHEIDUNG
INFEKTIOESER
DICTYOCAULUS
VIVIPARUS-LARVEN
.
47
3.1.7
IN
VITRO
KULTIVIERUNG
.
47
3.1.8
ISOLIERUNG
VON
LUNGENWURMLARVEN
NACH
EXPERIMENTELLER
INFEKTION
.
48
3.1.9
DEGRADATION
DER
PARASITENMEMBRANEN
.
48
3.1.10
RNA-ISOLIERUNG
.
49
3.1.10.1
GESAMT-RNA-ISOLIERUNG
.
49
3.1.10.1.1
ISOLIERUNG
MITTELS
GTC-PHENOL-CHLOROFORM
EXTRAKTION
.
50
3.1.10.1.2
ISOLIERUNG
MITTELS
SILICA-MEMBRAN
.
50
3.1.10.2
MRNA-ISOLIERUNG
.
50
3.1.11
QUANTITATIVE
BESTIMMUNG
DER
ISOLIERTEN
RNA
.
51
3.1.12
DOKUMENTATION
DER
NUKLEINSAEUREN
AUS
ISOLIERUNG
UND
PCR
.
52
3.1.13
CDNA-SYNTHESE
.
52
3.1.13.1
UNGEBUNDENE
CDNA
.
53
3.1.13.2
FESTPHASEN
CDNA-SYNTHESE
.
53
3.1.14
DETERMINATION
DER
CDNA-3'
ENDEN
.
54
3.1.14.1
OLIGO(DG)-TAILING
.
54
3.1.14.2
SINGLE
STRANDED
LIGATION
TO
CDNA
(SLIC)
.
54
3.1.15
ZWEITSTRANGSYNTHESE
.
55
3.1.15.1
ZWEITSTRANGPRIMER
.
55
3.1.15.2
REAKTIONSBEDINGUNGEN
.
56
3.1.16
CDNA-POLYMERASE
CHAIN
REACTION
(PCR)
.
57
3.1.16.1
CDNA-PCR-PRIMER
.
59
3.1.16.2
CDNA-PCR-REAKTIONSBEDINGUNGEN
.
59
3.1.17
POSITIV
PCR-KONTROLLE
.
61
3.1.18
KLONIERUNG
DER
PCR-AMPLIFIKATE
.
63
3.1.18.1
EXPRESSIONSVEKTOREN
.
63
3.1.18.2
AUFREINIGUNG
DER
PCR-AMPLIFIKATE
.
63
3.1.18.3
RESTRIKTIONSENZYMVERDAU
.
64
3.1.18.4
LIGATION
.
64
3.1.18.5
BLAU/WEISS-SELEKTION
.
65
3.1.18.6
AMPLIFIKATION
DER
CDNA-BANKEN
.
65
3.1.19
HERSTELLUNG
EINER
DIG-MARKIERTEN
CDNA-SONDE
VON
DICTYOCAULUS
VIVIPARUS
.
66
3.1.20
UEBERPRUEFUNG
DER
DIG-MARKIERTEN
CDNA-SONDE
.
66
3.1.21
PLAQUE
SCREENING
DER
2.
L3-PCR-CDNA-BANK
.
67
3.1.22
IN
VIVO
EXZISION
EINIGER
REAGENTEN
.
68
3.1.24
PLASMID
PRAEPARATION
UND
DARSTELLUNG
DER
INSERTS
.
69
3.1.24.1
MINIPREP-ANSAETZE
.
69
3.1.24.2
MIDIPREP-ANSAETZE
.
69
3.1.24.3
RESTRIKTIONSVERDAU
VON
DNA
REKOMBINANTER
KLONE
.
69
3.1.25
AMPLIFIKATION
DER
INSERTS
.
70
3.1.25.1
AMPLIFIKATION
MITTELS
SEQUENZIERPRIMEM
.
70
3.1.25.1
AMPLIFIKATION
MITTELS
CDNA-PCR-PRIMEM
.
70
3.1.26
HYBRIDISIERUNG
DER
AMPLIFIZIERTEN
INSERTS
MIT
DER
DIG-CDNA
SONDE
.
71
3.1.27
SEQUENZIERUNG
DER
INSERTS
.
71
3.1.27.1
SEQUENZIERUNG
MIT
T7-DNA-POLYMERASE
.
71
3.1.27.2
CYCLE
SEQUENCING
.
72
3.1.27.3
AUTOMATISCHE
SEQUENZIERUNG
.
73
3.1.28
SEQUENZHOMOLOGIEVERGLEICH
MITTELS
EMBL-DATENBANK
.
73
3.2
ERGEBNISSE
.
74
3.2.1
DEGRADATION
DER
PARASITENMEMBRAN
.
74
3.2.2
RNA-ISOLIERUNG
.
75
3.2.2.1
QUANTITATIVE
UNTERSUCHUNG
DES
RNA-GEHALTS
DRITTER
LUNGENWURMLARVEN
.
75
3.2.2.2
QUALITATIVE
DARSTELLUNG
DER
ISOLIERTEN
GESAMT-RNA
.
77
3.2.2.3
INDIREKTE
QUALITATIVE
KONTROLLE
DER
ISOLIERTEN
MRNA
.
79
3.2.3
CDNA-PCR
.
80
3.2.3.1
VERGLEICH
VERSCHIEDENER
TECHNIKEN
.
80
3.2.3.2
EFFIZIENZ
DER
FEST-PHASEN-CDNA-PCR
NACH
OLIGO(DG)-TAILING
.
82
3.2.3.3
ZUR
KONSTRUKTION
VON
PCR-CDNA-BANKEN
VERWENDETE
AMPLIFIKATE
.
84
3.2.4
KLONIERUNG
DER
CDNA-PCR-PRODUKTE
.
86
3.2.5
CHARAKTERISIERUNG
DER
2.
L3-PCR-CDNA-BANK
.
87
3.2.5.1
HERSTELLUNG
UND
EINSATZ
EINER
DIG-CDNA-SONDE
.
87
3.2.5.2
DARSTELLUNG
ZWEIER
REKOMBINANTER
KLONE
.
88
3.2.5.2.1
AMPLIFIKATION
UND
HYBRIDISIERUNG
DER
INSERTS
.
89
3.2.5.2.2
SEQUENZIERUNG
DER
INSERTS
.
90
3.2.5.2.3
SEQUENZHOMOLOGIEVERGLEICH
.
92
3.2.6
UEBERPRUEFUNG
DER
L4/L5-PCR-CDNA-BANK
.
92
3.2.6.1
SEQUENZDATEN
EINIGER
KLONE
AUS
DER
L4/L5-PCR
CDNA-BANK
.
93
3.2.6.2
SEQUENZHOMOLOGIEVERGLEICH
.
95
3.2.7
IN
VITRO
KULTIVIERUNG
.
95
3.2.7.1
ENTSCHEIDUNG
DER
INFEKTIOESEN
DICTYOCAULUS
VIVIPARUS
LARVEN
.
95
3.2.7.2
WEITERENTWICKLUNGSRATEN
BEI
VERSCHIEDENEN
CO
2
-
INKUBATIONSBEDINGUNGEN
.
95
3.2.7.3
STATISTISCHE
AUSWERTUNG
DER
IN
VITRO
KULTIVIERUNGSVERSUCHE
.
99
4
DISKUSSION
.100
4.1
RNA-ISOLIERUNG
AUS
LUNGENWURMLARVEN
.
101
4.2
ETABLIERUNG
UND
VERGLEICH
VON
CDNA-PCR-VERFAHREN
.
104
4.3
KONSTRUKTION
VON
PCR-CDNA-BANKEN
AUS
DICTYOCAULUS
VIVIPARUS-LARVEN
.
107
4.4
UNTERSUCHUNGEN
IM
RAHMEN
DER
IN
VITRO
KULTIVIERUNG
.
109
4.5
ZUSAMMENFASSENDE
BEURTEILUNG
UND
AUSBLICK
.
111
5
ZUSAMMENFASSUNG
.
113
6
LITERATURVERZEICHNIS
.
117 |
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