Charakterisierung der molekularen Determinanten der Infektion mit Prionen am Zellkulturmodell:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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2008
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| adam_text | Titel: Charakterisierung der molekularen Determinanten der Infektion mit Prionen am Zellkulturmodell
Autor: Reznicek, Lukas
Jahr: 2008
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG 1
1.1 Humane Prionerkrankungen 1
1.2 Prionerkrankungen im Tierreich 3
1.3 PrP 4
1.3.1 Ätiologie der Prionerkrankungen: Von der Parasiten- zur Prion-Hypothese 4
1.3.2 Charakterisierung von PrP 5
1.4 Konversion von PrPc zu PrPSc 7
1.4.1 „Nucleation seeding -Hypothese 7
1.4.2 „Heterodimer -Hypothese 8
1.5 PrPs= 8
1.5.1 Möglichkeiten der Übertragung 8
1.5.2 Von Eintrittspforte zum Zielorgan ZNS 8
1.5.2 Speziesbarriere 9
1.5.3 Erregerstämme 9
1.6 PrPSc und das Immunsystem 10
1.7 Suche nach Determinanten der Infektion 11
1.8 Fragestellung 12
2 MATERIAL 13
2.1 Geräte 13
2.2 Kits 13
2.3 Lösungen und Puffer 14
2.4 Reagenzien und sonstiges Material 16
3 METHODEN 18
3.1 Zellkultur 18
3.1.1 Einfrieren von Zellen 18
III
3.1.2 Auftauen von Zellen 18
3.1.3 Passagieren von Zellen 19
3.1.4 Mykoplasmentest 19
3.2 Infektiöses Inokulum 20
3.2.1 Herstellung des unbeschallten infektiösen Agens 20
3.2.2 Herstellung des beschallten infektiösen Agens 21
3.2.2.1 Anreicherung des Prps = 21
3.2.2.2 Beschallung des PrPSc 21
3.2.2.3 Überprüfen der Fragmentierung von PrPSc auf Westernblotebene 22
3.3 Infektion 23
3.3.1 Direkte Infektion ohne Metallnetze 23
3.3.2 Indirekte Infektion mit Metallnetzen 23
3.4 Untersuchungen auf Proteinebene 24
3.4.1 Herstellung des ZelUysats 24
3.4.2 Gelelektrophoretische Auftrennung (SDS-Page) 25
3.4.3 Probenvorbereitung, Referenzproben und Elektrophoresebedingungen 26
3.4.4 Westernblot 27
3.4.4.1 ElektrotransferaufPVDF-Membran 27
3.4.4.2 Blocken der Membran und Immunfärbung 27
3.4.4.3 Chemolumineszenz 28
3.4.4.4 „Stripping und „Reprobing 28
3.5 Untersuchungen auf molekularer Ebene 29
3.5.1 RNA-Gewinnung und reverse Transkription in cDNA 29
3.5.2 LightCycler-RT-PCR 30
3.5.2.1 Prinzip der Methode 30
2.5.2.2 Durchführung 32
4 ERGEBNISSE 34
4.1 Teilprojekt 1: Vergleichende Untersuchungen zur Genexpression infizierter
und nicht infizierter Zeilklone mittels LightCycler-RT-PCR 34
4.1.1 Vorarbeiten und Untersuchungsstrategie 34
4.1.2 Infektion von N2a-Zellklonen mit Scrapie-Hirnhomogenat 35
IV
4.1.3 Expression des SNAP-25 Gens in infizierten und nicht infizierten
Zeilklonen 36
4.1.4 Expression der Gene IGF-1R, ADAM 10, TACE, CTS D und S100 A6
in infizierten und nicht infizierten Zellklonen 40
4.2 Teilprojekt 2: Infizierbarkeit heterogener N2a-Subklone 43
4.2.1 Zielsetzung und Vorarbeiten 43
4.2.2 Infektionsversuch verschiedener durch Einzelzellklonierung
gewonnener Zellklone 43
4.3 Teilprojekt 3: Abhängigkeit der Infektiosität des Inokulums von der Anzahl
und Größenverteilung der PrPSc-Partikel 46
4.3.1 Vorarbeiten und Zielsetzung 46
4.3.2 Vorversuche 46
4.3.3 Infektionsversuch mit beschalltem Inokulum 49
S DISKUSSION 55
5.1 Teilprojekt 1: Vergleichende Untersuchungen zur Expression ausgewählter Gene
zwischen infizierten Zellklonen und ihren nicht infizierten Klonpartnern 55
5.1.1 Untersuchungsstrategie 55
5.1.2 Expressionslevel der untersuchten Gene SNAP-25, IGF-1R, ADAM-10,
TACE,CTSDundS100A6 55
5.1.2.1 Expression des SNAP-25 Gens 55
5.1.2.2 Expression des IGF-1R Gens 57
5.1.2.3 Expression des ADAM 10 Gens 58
5.1.2.4 Expression des TACE Gens 59
5.1.2.5 Expression des CTS D Gens 59
5.1.2.6 Expression des S100 A6 Gens 60
5.1.3 Zusammenfassende Darstellung des ersten Teilprojekts 61
5.2 Teilprojekt 2: Unterschiede in der Infizierbarkeit heterogener N2a-Subklone 62
5.3 Teilprojekt 3: Veränderte Infektiosität des Inokulums nach
Fragmentierung der PrPSc-Partikel 63
V
6 ZUSAMMENFASSUNG 67
Literaturverzeichnis 69
Abkürzungen 84
Danksagung 86
Lebenslauf 87
VI
|
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