Fluoreszenzindikatoren für intrazelluläre Natriumkonzentrationsmessungen:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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2008
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis III
1 Einleitung 1
1.1 Bedeutung der intrazellulären Natrium - Messungen 1
1.2 Methoden für intrazelluläre Natriummessungen 2
1.2.1 Techniken, die die totale intrazelluläre Natriumkonzentration messen, jedoch
eine Zerstörung der Zellen zur Folge haben 2
1.2.2 NMR Techniken für intrazelluläre Natriumbestimmungen 2
1.2.3 Techniken für intrazelluläre Natriummessungen auf der Basis definierter
physikochemischer Gleichgewichte 3
1.3 Fluoreszenz 4
1.3.1 Grundlagen der Fluoreszenzentstehung 4
1.3.2 Quantenausbeute und Fluoreszenzlebensdauer 6
1.4 Fluoreszenzionenindikatoren.... 9
1.4.1 Theoretische Grundlagen 9
1.5 Natriumsensitive Fluoreszenzionenindikatoren 14
1.5.1 Anforderungen an einen idealen Natriumindikator 14
1.5.2 Struktur und Selektivität kommerziell erhältlicher Natriumindikatoren 15
1.5.3 Natriumabhängige Änderungen des Fluoreszenzsignals kommerzieller
Natriumindikatoren 17
1.5.4 Beladung der Zellen mit den Fluoreszenzindikatoren 19
1.5.5 Eichung der Indikatoren in den Zellen 20
1.5.6 Beeinträchtigung der Indikatoren durch den pH-Wert und intrazelluläre
Proteine 21
1.6 Nanopartikel für die Messung intrazellulärer Ionenkonzentrationen 23
1.6.1 Acrylamid - Nanopartikel 23
1.6.2 Decylmethacrylat Nanopartikel 24
1.7 Zielstellung dieser Arbeit........................................................................................ 26
2 Methoden 27
2.1 Lösungen. 27
2.2 Zellen 27
2.2.1 Zellkultur 27
2.2.2 Beladung der Zellen mit dem membrangängigen Natriumindikator Sodium
Green - Tetraacetat 27
2.2.3 Eichung der intrazellulären Natriumkonzentration 28
23 Fluoreszenzspektroskopische Methoden... ..... .. 29
2.3.1 Bestimmung der Fluoreszenz - und Absorptionsspektren 29
2.3.2 Fluoreszenzintensitätsmessungen für die Bestimmung intrazellulärer
Natriumkonzentrationen 29
2.3.3 Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauern 33
-_
2.4 Polymerpartikel 38
2.4.1 Herstellung der Polymerpartikel 38
2.4.2 Beladung der Zellen mit den Nanopartikeln 40
2.5 Auswertung der Daten 43
2.5.1 Auswertung der Fluoreszenzintensitätsmessungen 43
2.5.2 Auswertung der Fluoreszenzlebensdauermessungen 43
3 Ergebnisse 46
3.1 Fluoreszenzanregungs - und Fluoreszenzemissionsspektrum des
Natriumindikators Sodium Green 46
3.2 Fluoreszenzintensitätsmessungen des Indikators Sodium Green.......................47
3.2.1 Fluoreszenzintensitätsänderungen des Indikators Sodium Green in
Abhängigkeit von variablen Natriumkonzentrationen 47
3.2.2 Fluoreszenzintensitätsänderung des Indikators Sodium Green in Abhängigkeit
von Kalium 49
3.2.3 Fluoreszenzintensitätsänderung des Indikators Sodium Green in Gegenwart
von Natrium und Kalium 49
3.2.4 pH-Wertabhängigkeit des Sodium Greens in Gegenwart von Natrium und
Kalium 50
3.2.5 Fluoreszenzintensitätsänderung des Farbstoffes Sodium Green in Gegenwart
von Natrium, Kalium und BSA 51
3.2.6 Intensitätsmessungen mit Sodium Green in der Zelle 53
3.3 Absorptionsänderung des Fluoreszenzindikators Sodium Green 56
3.3.1 Absorptionsänderung des Fluoreszenzindikators Sodium Green in Gegenwart
steigender Natrium - und Kaliumkonzentrationen 56
3.3.2 Absorptionseigenschaften des Fluoreszenzindikators Sodium Green in
Gegenwart steigender Natriumkonzentrationen und BSA 57
3.4 Natriumabhängige Intensitätsmessungen des Indikators Sodium Green in
Acrylamid - Nanopartikeln 57
3.4.1 Der Einschluss des Indikators Sodium Green in Acrylamid - Nanopartikel
verhindert die Interaktion mit Proteinen 57
3.4.2 Intensitätsmessungen des Farbstoffes Sodium Green in Acrylamid -
Nanopartikeln 59
3.4.3 pH-Wertabhängigkeit des Indikators Sodium Green in Acrylamid -
Nanopartikeln 61
3.4.4 Ratiometrische Intensitätsmessungen mit Sodium Green und Texas Red
beladenen Acrylamid - Nanopartikeln 62
3.4.5 Intensitätsmessungen mit Sodium Green / Texas Red Nanosensoren in CHO-
Zellen 66
3.4.6 Lokalisation der Nanopartikel in der Zelle 68
3.4.7 Reaktionszeit der Acrylamid - Nanopartikel 70
3.5 Fluoreszenzlebensdauermessungen des Fluoreszenzindikators Sodium Green 72
3.5.1 Fluoreszenzlebensdaueränderung des Indikators Sodium Green in
Abhängigkeit variabler Natriumkonzentrationen 72
3.5.2 Fluoreszenzlebensdaueränderung des Indikators Sodium Green in
Abhängigkeit variabler Kaliumkonzentrationen 78
_ -—
3.5.3 Fluoreszenzlebensdaueränderung des Indikators Sodium Green in Gegenwart
von Natrium und Kalium 79
3.5.4 Fluoreszenzlebensdaueränderung des Indikators Sodium Green in Gegenwart
von Rinderserum-Albumin (BSA) 82
3.5.5 Fluoreszenzlebensdaueränderung des Indikators Sodium Green in der Zelle . 84
3.5.6 Abhängigkeit der Fluoreszenzlebensdauer von der Indikatorkonzentration
(Sodium Green) 86
3.6 Fluoreszenzlebensdauermessungen des Fluoreszenzindikators CoroNa Green 87
3.6.1 Fluoreszenzlebensdaueränderung des Indikators CoronNa Green in
Abhängigkeit variabler Natriumkonzentrationen 88
3.6.2 Einfluss von Kalium auf die Fluoreszenzlebensdauer des Indikators CoroNa
Green 92
3.6.3 Fluoreszenzlebensdaueränderung des Indikators CoroNa Green in Gegenwart
von Natrium und Kalium 94
3.6.4 Fluoreszenzlebensdaueränderung des Indikators CoroNa Green in Gegenwart
von BSA 96
4 Diskussion 99
4.1 Fluoreszenzintensitätsänderung des Indikators Sodium Green 99
4.1.1 Fluoreszenzintensitätsänderung des Indikators Sodium Green in Abhängigkeit
der Natrium- und Kaliumkonzentration 99
4.1.2 Der Einfluss von Kalium auf die natriumabhängige
Fluoreszenzintensitätsänderung des Indikators Sodium Green 100
4.2 Absorption des Indikators Sodium Green 101
4.3 Natriumabhängige Fluoreszenzlebensdaueränderung des Indikators Sodium
Green 102
4.3.1 Natriumabhängige Fluoreszenzlebensdaueränderung des Indikators Sodium
Green 102
4.3.2 Der Einfluss von Kalium auf die natriumabhängige Fluoreszenz-lebensdauer-
änderung des Indikators Sodium Green 104
4.3.3 Abhängigkeit der Sodium Green Fluoreszenzlebensdauer von der
Indikatorkonzentration selbst 104
4.4 Interaktion des Indikators Sodium Green mit Proteinen 105
4.4.1 Natriumabhängige Fluoreszenzintensitätsänderung des Indikators Sodium
Green in Gegenwart von BSA 105
4.4.2 Einfluss von BSA auf die Fluoreszenzlebensdaueränderung des Indikators
Sodium Green 107
4.4.3 Vergleich der Fluoreszenzintensitäts- und der
Fluoreszenzlebensdauemessungen mit Sodium Geen 107
4.5 Natriumabhängige Fluoreszenzlebensdaueränderung des Indikators CoroNa
Green.... . . . ..... . 108
4.6 Der Einfluss von BSA auf den Indikator CoroNa Green 109
4.6.1 Einfluss von BSA auf die Fluoreszenzlebensdaueränderung des Indikators
CoroNa Green 109
4.7 Sodium Green in Polyacrylamid Nanosensoren ...................... 110
___ _
4.7.1 Der Einschluss des Indikators Sodium Green in Polyacrylamid Nanopartikeln
verhindert die Interaktion mit Proteinen 110
4.7.2 Natriummessungen mithilfe von Sodium Green Nanosensoren 110
4.7.3 Ratiometrische Polyacrylamid Nanosensoren mit Sodium Green und Texas
Red 111
4.8 Ist der Indikator Sodium Green geeignet für Natriummessungen
in der Zelle? 112
4.8.1 Natriummessungen mit Sodium Green in der Zelle 112
4.8.2 Natriummessungen mit Sodium Green-Nanosensoren in der Zelle 113
5 Zusammenfassung 114
6 Anhang 118
6.1 Mono- und Multiexponentielle Fluoreszenzabfälle 118
6.1.1 Fläche unter der Fluoreszenzabklingkurve 118
6.1.2 Durchschnittliche Lebensdauer im angeregten Zustand 118
6.1.3 Durchschnittliche Lebensdauer bei multiexponentiellen
Fluoreszenzabfällen 118
6.2 Bestimmung des Kd - Wertes 119
7 Literaturverzeichnis 124
Danksagung 135
Lebenslauf. 136
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