Charakterisierung molekularer Mechanismen der antiangiogenen Aktivität von GBP-1 in Endothelzellen:
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| adam_text | Titel: Charakterisierung molekularer Mechanismen der antiangiogenen Aktivität von GBP-1 in Endothelzellen
Autor: Weinländer, Kristina
Jahr: 2008
Inhaltsverzeichnis I
1 ZUSAMMENFASSUNG 1
SUMMARY 2
2 EINLEITUNG 3
2.1 Die Bildung neuer BLUTGEFÄßE: Vaskulogenese und Angiogenese 3
2.1.1 Die Aktivierungsphase der Angiogenese 5
2.1.2 Die Reifungsphase der Angiogenese 7
2.2 INTEGRINE UND IHRE BEDEUTUNG WÄHREND DER ANGIOGENESE 8
2.2.1 Allgemeiner Aufbau von Integrinen und Integrin-vermittelte Signalwege 9
2.2.2 Integrineund ihre Bedeutung bei der Migration von Endothelzellen 12
2.2.3 Integrina* 13
2.3 Inflammatorische Zytokine und ihre Wirkung auf Endothelzellen 14
2.3.1 Die Wirkung von IL-1 und TNF-oc auf Endothelzellen 15
2.3.2 Der Einfluss von IFN-y auf Endothelzellen 15
2.4 DasGuanylatbindungsprotein-1 16
2.4.1 Biochemische Eigenschaften und Struktur von GBP-1 17
2.4.2 Expression und transkriptioneile Regulation von GBP-1 18
2.4.3 Funktionen von GBP-1 18
2.5 Ziele dieser Arbeit 19
3 MATERIAL UND METHODEN 21
3.1 Material 21
3.1.1 Spezielle Chemikalien 21
3.1.2 Spezielle Verbrauchsmittel 21
3.1.3 Kommerzielle Reagenziensätze 21
3.1.4 Enzyme 22
3.1.5 Primärantikörper 22
3.1.6 Sekundärantikörper 22
3.1.7 Plasmide 23
3.1.8 Biologisches Material 24
3.1.8.1 Bakterienstamm 24
3.1.8.2 Eukaryontische Zellen 24
3.1.9 Medien 24
3.1.9.1 Bakterien-Nährmedium 24
3.1.9.2 Zellkultur-Nährmedien 25
3.2 Zellbiologische Methoden 26
3.2.1 Kultivierung von Säugerzellen 26
3.2.2 Stimulierung von primären Endothelzellen mit inflammatorischen Zytokinen 27
3.2.3 Herstellung retroviraler Partikel 27
3.2.3.1 Produktion von infektiösen PG13-Überständen 27
3.2.3.2 Produktion infektiöser Partikel in HEK293T-Zellen 28
3.2.4 Retrovirale Transduktion von HUVEC 28
3.2.4.1 Infektion mit PG13-Überständen 29
3.2.4.2 Infektion mit viralen Partikeln aus HEK293T 29
3.2.5 Untersuchungen zur Bildung endothelialer Lamellipodien 29
3.2.6 In vitro Wundheilungstest 30
3.2.7 Durchflusszytometrie (FACS) 30
3.3 Molekularbiologische Methoden 32
Inhaltsverzeichnis II
3.3.1 Isolierung von Plasmid-DNA ausE. coli 32
3.3.2 Bestimmung von Nukleinsäurekonzentrationen 32
3.3.3 Restriktionsspaltungen von DNA 32
3.3.4 Agarose-Gelelektrophorese 33
3.3.4.1 Größenstandards für die Agarose-Gelelektrophorese 34
3.3.4.2 Elution von DNA aus Agarosegelen 34
3.3.5 Auffüllen von 5 -Überhängen mit dem „Klenow -Fragment der DNA-Polymerase I... 34
3.3.6 Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten 35
3.3.7 Ligation von DNA-Fragmenten 35
3.3.8 Transformation von kompetenten E. co//-Zellen 35
3.3.9 Sequenzierung von DNA 36
3.3.10 Isolierung von zellulärer Gesamt-RNA 36
3.3.11 Microarray-Analyse 37
3.3.12 Reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) 38
3.3.12.1 cDNA-Synthese 38
3.3.12.2 Polymerasekettenreaktion (PCR) 39
3.3.13 RNase ProtectionAssay(RPA) 40
3.3.13.1 In vitro Transkription zur Herstellung Biotin-markierter RNA-Sonden 41
3.3.13.2 RNA-Probenvorbereitung und Hybridisierung 41
3.3.13.3 RNase A-Behandlung 42
3.3.13.4 Tris-Borat-Harnstoff-Gelelektrophorese und Membrantransfer 42
3.3.13.5 Proben-Detektion 43
3.3.14 Quantifizierung und Normalisierung von Bandensignalen 43
3.4 Proteinbiochemische Methoden 44
3.4.1 Herstellung von Gesamtproteinzeilextrakten 44
3.4.2 Bestimmung von Gesamtproteinkonzentrationen 44
3.4.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 44
3.4.4 Westernblot- Analyse 46
3.4.5 Immunfärbung des Westernblots 46
3.5 Statistik 46
4 Ergebnisse... ........... .............. ............ ....... ........ ......... ...... 48
4.1 Die ektopische Expression von GBP-1 hemmt die Bildung stabiler
Lamellipodien und die Migration von endothelzellen auf FN 48
4.1.1 Ektopische Expression und Nachweis von GBP-1 in HUVEC 48
4.1.2 Die ektopische Expression von GBP-1 hemmt die Bildung endothelialer
Lamellipodien auf FN-beschichteten Oberflächen 49
4.1.3 Die ektopische Expression von GBP-1 hemmt die Migration von Endothelzellen
auf FN-beschichteten Oberflächen 51
4.2 GBP-1 induziert die Expression von Integrin a4 in Endothelzellen 53
4.2.1 Identifizierung von GBP-1-regulierten Genen mittels Microarray-Analyse 53
4.2.2 GBP-1 erhöht die mRNA-Transkription von itga4 in Endothelzellen 54
4.2.3 GBP-1 induziert die Exposition von ITGA4 an der Oberfläche von Endothelzellen 57
4.3 Die GTPase-Aktivität von GBP-1 ist an der Hochregulation der ITGA4-
EXPRESSION BETEILIGT 58
4.4 Die GBP-1 -vermittelte Hemmung der Lamellipodienbildung und der
Migration ist abhängig von der Bindung zwischen ITGA4 und FN 60
4.5 IL-1 ß und TNF-a induzieren die Oberflächenexpression von ITGA4 und
HEMMEN DIE LAMELLIPODIENBILDUNG VON HUVEC AUF FN 64
Inhaltsverzeichnis III
4.5.1 Nachweis von endogenem GBP-1 in IL-1 ß-, TNF-a- und IFN-y-behandelten HUVEC 64
4.5.2 IL-lß und TNF-a induzieren die Oberflächenexpression von ITGA4 65
4.5.3 IL-lß und TNF-a hemmen die Bildung endothelialer Lamellipodien auf
FN-beschichteten Oberflächen in Abhägigkeit von ITGA4 66
4.6 GBP-1 VERMITTELT DIE DURCH IL-1 ß- UND TNF-OC-INDUZIERTE HEMMUNG DER
LAMELLIPODIENBILDUNG UND DER MIGRATION DURCH INDUKTION VON ITGA4 68
4.6.1 Klonierung der shRNAs in retrovirale Expressionsplasmide 68
4.6.2 Nachweis von endogenem GBP-1 in Ktrl-shRNA- und GBP-1-shRNA-
exprimierenden HUVEC nach Stimulation mit IL-1 ß und TNF-a 70
4.6.3 GBP-1 ist notwendig zur Induktion der FTGA4-Expression nach Stimulierung
mit IL-lß und TNF-a 71
4.6.4 GBP-1 ist zur Hemmung der endothelialen Lamellipodienbildung auf FN-
beschichteten Oberflächen nach Stimulierung mit IL-1 ß und TNF-a notwendig 71
4.6.5 GBP-1 ist zur Hemmung der Migration von HUVEC durch IL-1 ß und TNF-a
notwendig 74
5 Diskussion 76
5.1 GBP-1 induziert die Expression von LTGA4 in Endothelzellen 76
5.2 gbp-1 ist hinreichend für die hemmung der lamellipodienbildung und
Migration von endothelzellen auf FN-beschichteten Oberflächen 78
5.3 Die inflammatorischen Zytokine IL-1 ß und TNF-a, aber nicht IFN-y
hemmen die bildung endothelialer lamellipodien durch eine gbp-1 -
vermittelte induktion von itga4 79
5.4 Modelle zur Hemmung der endothelialen Lamellipodienbildung nach
Behandlung mit IL-lß/TNF-a bzw. IFN-y. 82
5.5 Die Bedeutung der GBP-1 -abhängigen ITGA4-Expression in
endothelzellen im kontext einer entzündungsreaktion unter
physiologischen Bedingungen 86
6 Literaturverzeichnis 88
7 Abkürzungsverzeichnis 102
8 Lebenslauf. 106
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| title_full | Charakterisierung molekularer Mechanismen der antiangiogenen Aktivität von GBP-1 in Endothelzellen von Kristina Weinländer |
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