Untersuchung CD4+CD25+-regulatorischer T-Zellen im Verlauf der spezifischen Immuntherapie (SIT) mit Insektengift:
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2008
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Abkürzungen 4
1. Einleitung 7
1.1. Insektenstichreaktionen 7
1.1.1. Die Typ-I-Allergie gegen Insektengift 7
1.1.1.1. Klinik, Diagnose und Therapie 7
1.1.1.2. Prävalenz und Risikofaktoren 8
1.1.2. Die gesteigerte örtliche Insektenstichreaktion 8
1.2. Pathomechanismus der Insektengiftallergie 9
1.3. Die spezifische Immuntherapie (SIT) 10
1.3.1. Die SIT bei Insektengiftallergie 10
1.3.1.1. Indikation und Kontraindikationen 10
1.3.1.2. Durchführung und Nebenwirkungen 10
1.3.1.3. Wirksamkeit und Erfolgskontrolle 12
1.3.1.4. Perspektiven 12
1.4. Wirkmechanismus der spezifischen Immuntherapie (SIT) 12
1.4.1. Induktion von Anergie durch IL-10 und/oder TGF-ß bildende regulatorische T-Zellen 12
1.4.2. Anerge T-Zellen werden durch Zytokine reaktiviert 13
1.4.3. Aktivierungsverhältnis wird von TH2- zu TH1- dominierter Immunantwort verschoben 13
1.4.4. Wirkung auf B-Zellen und veränderte Antikörperbildung 13
1.4.5. Wirkung der SIT auf Dendritische Zellen (DCs), Mastzellen und Basophile 14
1.5. Relevante immunologische Grundlagen 14
1.6. Regulatorische T-Zellen (Tregs) 15
1.6.1. Phänotypische Charakterisierung 15
1.6.2. Funktionelle Charakterisierung 15
1.6.3. Unterscheidung verschiedener Subpopulationen 16
1.6.3.1. Im Thymus gebildete Tregs (nTregs) 16
1.6.3.2. Induzierbare Tregs (iTregs) 16
1.7. Die Bedeutung der regulatorischen T-Zellen bei Pathogenese und Therapie der
Insektengiftallergie 18
1.8. Ziel der Arbeit l9
2. Materialien und Methoden 20
2.1. Materialien 20
2.1.1. Peripheres humanes Blut 20
2.1.2. Reagenzien, Medien und Stimulanzien 20
2.1.3. Verbrauchsmaterialien 21
2.1.4. Geräte 21
2.1.5. Antikörper 22
2.1.6. Protokolle der Medien und Pufferlösungen 23
2.2. Die Versuchsdurchführung im Überblick 23
2.3. Isolierung peripherer Blut-Leukozyten aus dem peripheren Blut 25
2.3.1. Dichtegradienten-Zentrifugation mit Ficoll-Paque™ 25
2.3.2. Kryokonservierung der PBMCs 25
2.4. Isolierung CD4+CD25+ positiver T-Zellen 26
2.4.1. Magnet-assoziierte Zeil-Separation 26
2.4.2. Negativselektion CD4+ T-Zellen mittels Magnet-assoziierter Zeil-Separation 26
2.4.3. Positivselektion CD4+CD25+T-Zellen mittels Magnet-assoziierter Zeil-Separation 27
2.4.4. Isolation von Dendritischen Zellen (DCs) 27
2.5. Charakterisierung der einzelnen Zellfraktionen mittels Durchflusszytometrie 28
2.5.1. Die Durchflusszytometrie 28
2.5.2. Phänotypische Charakterisierung der einzelnen Zellfraktionen 28
2.5.2.1. Fluoreszenzfärbung mit spezifischen Antikörpern und der Isotypkontrolle 28
2.5.2.2. Durchfiihrung der Fluoreszenzfärbungen 29
2.6. Funktionelle Untersuchung von T-Zellen mittels Proliferationsassay 29
2.6.1. Der Proliferationsassay 29
2.6.2. Radioaktivmarkierung mittels H3-Thymidin 30
2.6.3. Der ß-Zähler 31
2.7. Analyse und graphische Darstellung der Daten 31
2.7.1. Daten der phänotypischen Charakterisierung der Zellen 31
2.7.2. Daten der funktioneilen Charakterisierung der Zellen 31
2.7.3. Statistische Analysen 32
3. Ergebnisse 33
3.1. Phänotypische Charakterisierung isolierter Zellen mittels Durchflusszytometrie 33
3.1.1. Isolierte periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) 33
3.1.1.1. Anteil CD4+CD25+T-Zellen an PBMCs 33
3.1.1.2. Untersuchung weiterer T-Zell-Marker an der Population der PBMCs 34
3.1.2. Die Populationen CD25-positiver und CD25-negativer T-Lymphozyten 36
3.2. Funktionelle Charakterisierung der Zellen mittels H3-Thymidin Proliferationsassay 39
3.3. Untersuchungen der Zellen in Bezug auf die Pathogenese der Insektengiftallergie 42
2
3.3.1. Phänotypische Charakterisierung der PBMCs von gesunden Probanden, „Lokalpatienten
und Allergikern im Vergleich 42
3.3.2. Gegenüberstellung der funktioneilen Zellcharakterisierung von „Lokalpatienten und
Allergikern 43
3.4. Charakterisierung im Verlauf der Spezifischen Immuntherapie mit Insektengift 45
3.4.1. Phänotypische Charakterisierung der PBMCs 45
3.4.1.1. Anteil CD4+CD25+ bzw. CD4+CD25+highT-Zellen im Verlauf der SIT 45
3.4.2. Funktionelle Charakterisierung 46
4. Diskussion 54
5. Zusammenfassung der Arbeit 58
6. Literaturverzeichnis 61
Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 67
Lebenslauf 68
Danksagung 70
3
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