Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen die pathologische Isoform des Prionproteins:
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2008
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
1.1 Transmissible Spongiforme Enzephalopathien 1
1.1.1 Prionenals neuartige Erreger 2
1.1.2 Molekulare Grundlagen der TSE 3
1.1.2.1 Die zelluläre Form des Prionproteins 3
1.1.2.2 Das pathologische Prionprotein 7
1.1.2.3 Die Vermehrung von Prionen 8
1.1.3 Prionstämme und die Artenbarriere 10
1.1.4 Das Krankheitsbild der Transmissiblen Spongiformen Enzephalopathien 12
1.1.4.1 Die Rolle des Immunsystems in Transmissiblen Spongiformen
Enzephalopathien 12
1.1.5 Die Diagnose von Transmissiblen Spongiformen Enzephalopathien 13
1.2 Wichtige Prionerkrankungen im Überblick 15
1.2.1 Die Traberkrankheit 15
1.2.2 Die Bovine Spongiforme Enzephalopathie 18
1.2.3 Die chronisch zehrende Krankheit der Hirschartigen 19
1.2.4 Humane Prionerkrankungen 21
1.3.1 Antikörper gegen das zelluläre und pathologische Prionprotein 29
1.2.2 Monoklonale Antikörper gegen die pathologische Isoform PrPsc 30
1.4 Fragestellung der Arbeit 33
2. Material 34
2.1 Gewebeproben: 34
2.2 Geräte 35
2.3 Glaswaren 36
2.4 Chemikalien 37
2.5 Antikörper 39
2.6 Enzyme 39
2.7 Nährmediumzusätze 40
2.8 Kits 40
2.9 Adjuvanzien 40
2.10 Puffer und Lösungen 41
I
2.11 Mäuse 48
2.12 Medien 48
2.13 Primer 49
2.14 Plasmide 50
2.15 Software 50
2.16 Verbrauchsmittel 51
2.17 Verwendete Prionstämme 52
2.18 Zelllinien 53
3. Methoden 54
3.1 Molekularbiologische Methoden 54
3.1.1 Genotypisierung der Mäuse 54
3.1.2 Polymerasekettenreaktion 54
3.1.3 Agarose-Gelelektrophorese 55
3.1.4 Klonierung von Plasmiden 56
3.1.5 Plasmid-DNA Isolierung: 56
3.1.6 Restriktion von DNA-Fragmenten 57
3.1.7 Ligation von Plasmiden 57
3.1.8 Transformation von E.coli 57
3.1.9 Herstellung von transformationskompetenten £.co//-Bakterien 58
3.2 Zellkultur-Methoden 58
3.2.1 Kultivierung von Zellen 58
3.2.2 Kryokonservierung von Zellen 59
3.2.3 Auftauen von Zellen 59
3.2.4 Bestimmung der Zellzahl 60
3.3 Biochemische Methoden 60
3.3.1 Expression von rekombinanten Prionprotein in E.coli 60
3.3.2 Lösung des rekombinanten Prionprotein aus Einschlusskörperchen 61
3.3.3 Westernblot-Analyse von Gehirnhomogenat 62
3.3.4 Westernblot-Analyse von Zellen 63
3.3.5 Histoblot-Analyse 64
3.3.6 Zellblot-Analyse 65
3.4 Immunologische Methoden 67
3.4.1 Immunisierungen 67
II
3.4.1.1 Immunisierung mit Phosphorwolframsäure-gefälltem SDS-PAGE gereinigtem
PrPsc 67
3.4.1.2 Immunisierung nach Tolerisierung 69
3.4.1.3 Immunisierung mit nativen, pathologischen Wolframsäure-gefälltem PrPsc.. 70
3.4.2 Herstellung von monoklonalen Antikörpern 71
3.4.2.1 Die Hybridomtechnik 72
3.4.2.2 Fusion von Milzzellen mit Myelomzellen 74
3.4.2.3 Kultivierung von Hybridomen 75
3.4.2.4 Klonierung von Hybridomen 75
3.4.2.5 Produktion von Antikörpern 76
3.4.3 Charakterisierung der Antikörper 76
3.4.3.1 Identifikation von Antikörperproduzierenden Hybridomen mittels ELISA.. 76
3.4.3.2 Bestimmung der Isotypes von Antikörpermolekülen 77
3.4.3.3 Bestimmung der Antikörpermenge in Lösungen mittels ELISA 77
3.4.3.4 ELISA zur Selektion von PrP-bindenden Antikörpern 78
3.4.3.5 ELISA auf Gehirngewebe von Mäusen 79
3.2.3.6 ELISA auf Gehirngewebe von Schafen 80
3.2.3.7 Sandwich-ELISA von Schaf- und vCJD-Proben 81
3.2.3.8 DotBlot-Analyse von Gehirnhomogenat 8]
3.2.3.9 Aufreinigung von Antikörper-Molekülen mit Affinitätschromatographie .... 83
3.2.3.10 Photometrische Bestimmung der Proteinmenge in Lösungen 83
3.2.3.11 Durchflußzytometrie von Tg33-Milzzellen: 84
3.2.3.12 Durchflußzytometrie von Neuroblastonazellen 84
3.2.3.13 Immunhistologische Färbung des pathologischen Prionproteins 85
3.2.3.14 Immunfluoreszenzfärbungen 87
3.2.3.15 Antikörperbehandlung von Scrapie-Infizierten Zellen (ScN2a) 88
3.2.3.16 Behandlung von Scrapie-Zellen mit Single-Chain Antikörper 89
3.2.3.17 Immunpräzipitation von Prionprotein mit S.aureus 89
3.2.3.18 Immunpräzipitation von Prionprotein mit Dynabeads 91
3.2.3.19 Bestimmung der Epitop der monoklonalen Antikörper 91
4. Ergebnisse: 93
4.1 Generierung monoklonaler Antikörper 93
III
4.1.1 Immunisierungen von Mäusen mit Wolframsäure-gefälltem und SDS-PAQE
gereinigtem PrPsc 93
4.1.2 Immunisierung mit PrPsc nach Tolerisierung gegen PrPc 98
4.1.3 Immunisierung mit Phosphorwolframsäure gefälltem pathologischem
Prionprotein 02
4.2 Charakterisierung der PrP-spezifischen monoklonalen Antikörper 105
4.2.1 Bestimmung des Isotyps der PrP-spezifischen Antikörper 105
4.2.2 Bestimmung der Epitope der PrP-spezifischen Antikörper 105
4.2.3 Untersuchung der Spezies-Spezifität für die hergestellten Antikörper 106
4.2.4 Verwendung der PrP-spezifischen Antikörper in der Durchflußzytometrie an
Tg33-Müzzellen 109
4.2.5 Durchflußzytometrische Untersuchung an PrP-exprimierenden Neuroblastoma-
zellen , 113
4.2.6 Immunpräzipitation von pathologischem PrP* 115
4.2.7 Nachweis von PrP im Histoblot 119
4.2.8 Immunhistologische Untersuchungen mit den monoklonalen Antikörpern 130,
W226 und W827 121
4.2.9 Immunfluoreszenzmikroskopie mit den monoklonalen Antikörpern W226 und
W827 126
4.2.10 Untersuchungen zur Spezies-Spezifität des W226-Antikörpers 129
4.2.11 Bestimmung der Bindungsaffinität des mAKs W226 an rekombinantes
Prionprotein 136
4.2.12 Produktion von Hybridomüberstand des monoklonalen Antikörpers W226.138
4.2.13 Westerblotuntersuchungen zum Vergleich der Bindungsstärken von W226 und
6H4 an das zelluläre PrPc und das pathologische PrPsc 140
4.2.14 Behandlung von Scrapie-infizierten Neuroblastomazellen mit monoklonalen
Antikörpern 141
4.2.14.1 Westemblot-Analyse zur Behandlung von ScN2a-Zellen mit Antikörpern 141
4.2.14.2 Langzeitbehandlung von ScN2a-Zellen mit dem mAK W226 143
4.2.15 Herstellung eines Single-Chain Antikörpers aus dem mAk W226 151
4.2.16 Behandlung von Scrapie-infizierten Neuroblastomazellen mit dem scW226
Single-Chain Antikörper 152
4.3 Untersuchungen zur Identifikation von PrPsc-spezifischen Antikörpern 154
IV
4.3.1 Testsysteme zur Identifikation von PrPsc-spezifischen Antikörpern 154
4.3.1.1 ELISA auf Gehirngewebe von Scrapie-infrzieren Wildtyp-Mäusen 154
4.3.1.2 Testung der Hybridome mittels Immunpräzipitation 155
4.3.2 Charakterisierung der PrPsc-spezifischen Antikörper W140 und W261 157
4.3.2.1 Immunpräzipitationen von pathologischen Prionprotein 157
4.3.2.2 Versuche zur Bestimmung des Epitopes der monoklonalen Antikörper W261
undW140 168
4.3.2.3 Charakterisierung der monoklonalen Antikörper W261 und W140 im ELISA
171
5. Diskussion 178
5.1 Immunisierungen zur Herstellung von PrPsc-spezifischen Antikörpern 179
5.2 Charakterisierung der Prionprotein-spezifischen Antikörper 190
5.3 Die PrPsc-spezifischen Antikörper 204
6. Zusammenfassung 213
7. Summary 214
8. Eigene Publikationen und Patentanträge 215
9. Literaturverzeichnis 216
V
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