Biosynthetische und regulatorische Aspekte der Pristinamycin-Produktion in Streptomyces pristinaespiralis:
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2008
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adam_text | Titel: Biosynthetische und regulatorische Aspekte der Pristinamycin-Produktion in Streptomyces pristinaespi
Autor: Mast, Yvonne Jasmin
Jahr: 2008
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
I Zusammenfassung l
II Einleitung 3
1. Die Gattung Streptomyces 3
2. Antibiotika 4
2.1 Peptid-Antibiotika 6
2.2 Polyketid-Antibiotika 10
2.2.1 Typ I-Polyketidsynthasen 11
2.2.2 Typ n-Polyketidsynthasen 12
2.2.3 Typ III-Polyketidsynthasen 13
2.3 Hybride Peptid-Polyketid-Antibiotika 14
2.4 Regulation der Antibiotika-Biosynthese 15
2.4.1 Dasy-Butyrolacton-Regulationssystem 16
2.4.1.1 y-Butyrolactone 17
2.4.3 Repressoren der TetR-Familie 20
2.4.3.1 y-Butyrolacton-Rezeptoren 21
2.4.4 Aktivatoren der SARP-Familie 24
3. Das Streptogramin-Antibiotikum Pristinamycin 26
3.1 Struktur und Wirkungsweise von Pristinamycin 26
3.2 Die Pristinamycin-Biosynthesegenregion 30
3.3 Biosynthese von Pristinamycin 32
3.3.1 Biosynthese von Pristinamycin I 32
3.3.2 Biosynthese der aproteinogenen Aminosäure Phenylglycin 35
3.3.3 Biosynthese von Pristinamycin II 37
3.4 Regulation der Pristinamycin-Biosynthese 39
4. Ziel der Arbeit 41
III Material und Methoden 42
1. Bakterienstämme 42
2. Plasmide, Vektoren und Cosmide 42
3. Oligonukleotide 43
4. Nährmedien 44
Inhaltsverzeichnis
5. Antibiotika und Zusätze in Selektivplatten und -medien 46
6. Puffer und Lösungen 47
6.1 Lösungen für DNA-Präparationen 47
6.2 Lösungen für DNA-Gelelektrophoresen 47
6.3 Lösungen für Transformationsexperimente 48
6.4 Lösungen für Southern-Blot Experimente 49
6.5 Lösungen zum Strippen von Nylonmembranen 50
6.6 Lösungen zur Reinigung von His-tag-Fusionsproteinen 50
6.7 Lösungen zur Proteinbestimmung nach Bradford 50
6.8 Lösungen für die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 51
6.9 Lösungen für Immunoblotting-Experirnente 52
6.10 Lösungen zur Detektion von His-tag Proteinen 5 3
(InVision™ His-tag In-gel Stain) 53
7. Größenmarker, Enzyme, Kits, Chemikalien und andere Materialien 53
7.1 Größenmarker 53
7.2 Enzyme 54
7.3 Kits 54
7.4 Chemikalien und andere Materialien 5 5
8. Anzucht und Kultivierung von Mikroorganismen 57
8.1 Anzucht von E. coli 57
8.2 Anzucht von Streptomyceten 58
8.2.1 Anzucht von Streptomyceten für Fütterungsexperimente 58
8.3 Isolierung von Streptomycetensporen 58
9. DNA-Isolierung aus E. coli und Streptomyceten 59
9.1 Plasmidisolierung aus E. coli 59
9.1.1 Alkalische Lyse 59
9.1.1.1 Minipräparation: Gewinnung von Plasmid-DNA 59
9.1.1.2 Midipräparation: Gewinnung von Cosmid-DNA durch
QIAGEN-Lyse 60
9.1.1.4 Lyse nach Eckhard (1978) 60
9.1.1.5 Isolierung von Plasmid-DNA aus Streptomyceten
(modifiziert nach Kieser, 1984) 61
9.2 Isolierung genomischer DNA aus Streptomyceten 61
9.2.1 Phenol-Chloroform-Methode 61
I Inhaltsverzeichnis
9.2.2 KAc-Isopropanol-Fällung 62
10. Reinigung von DNA durch Alkoholfällung 62
11. Charakterisierung von DNA-Molekülen 63
11.1 Restriktionsspaltung von DNA 63
11.2Agarosegelelektrophorese 63
11.3 Bestimmung der DNA-Konzentration 64
i 12. Klonierungsexperimente 64
12.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 64
12.2 Isolierung von DNA-Fragmenten aus einem Agarosegel mit dem GFX™
PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Bioscience) 66
12.3 Reinigung von DNA-Fragmenten mit Microspin S-400 HR Columns 67
, 12.4 Ligation von Nukleinsäurefragmenten 67
13. DNA-Transfer bei Bakterien 67
13.1 Transformation von E. co/j -Stämmen 67
13.1.1 CaCl2-Methode (Cohen et al, 1972) 67
13.1.1.1 Herstellung kompetenter Zellen 67
13.1.1.2 Transformation 68
13.1.1.3 Blau-Weiss- Selektion von Transformanten 68
13.2 Protoplasten-Transformation bei Streptomyceten
(Hopwood et al, 1985; Kieser et al, 1982) 68
13.2.1 Herstellung von Protoplasten 68
13.2.2 Polyethylenglykol-induzierte Protoplasten-Transformation bei
Streptomyceten 69
14. Experimente zur Detektion nichtradioaktiv markierter DNA 69
14.1 Southern-Hybridisierung (nach Southern, 1975) 69
14.1.1 Southern Blot 69
14.1.2 Vakuumblotting mit LKB 2016 VacuGene 69
14.1.3 Nichtradioaktive Markierung eines DNA-Fragments 70
14.1.4 DNA-DNA-Hybridisierungen 71
14.1.5 Immunologischer Nachweis der markierten Sonde durch
NBT/BCIP-Färbung 71
14.1.6 Immunologischer Nachweis der markierten Sonde durch CSPD-Färbung 71
14.1.7 Strippen und Rehybridisierung der Nylonmembran 72
15. Bestimmung der Pristinamycin-Produktion 72
Inhaltsverzeichnis
15.1 Anzucht von S. pristinaespiralis -Stämmen zur
Pristinamycin-Produktionsanalyse 72
15.2 Extraktion von Pristinamycin aus dem Kulturmedium 73
15.3 Analyse der Pristinamycin-Produktion 73
15.3.1 Bestimmung der Pristinamycin-Produktion durch Biotest 73
15.3.1.1 Herstellungen 5ac;7/w subtiüs-Testplatten 73
15.3.1.2 Herstellung von Escherichia cofi-Testplatten 74
15.3.1.3 Blöckehentest 74
15.3.2 Bestimmung der Pristinamycin-Produktion durch HPLC 74
15.3.2.1 HPLC 74
15.3.2.2 HPLC-Geräteausstattung 75
16. Überexpression von Fusionsproteinen 76
16.1 Überexpression in E. coli BL21 76
16.2 Überexpression in S. pristinaespiralis 76
17. Zellaufschluss mit der French Press 76
18. Proteinbestimmung nach Bradford (1976) 77
19. Reinigung von überexprimiertem Fusionsprotein 77
19.1 Native Reinigung von His-tag-Fusionsproteinen mit
QIAGEN Ni-NTA Spin Columns 77
19.2 Native Reinigung von His-tag-Fusionsproteinen über
FPLC-Metall-Affinitätschromatographie 78
20. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 78
21. Detektion von His-tag Proteinen 79
21.1 Immunoblotting Experimente (Western Blot) 79
21.2 InVision™ His-tag In-gel Stak 80
22. Bandshift Assays 81
22.1 Bandshift Assays mit Cy5-gelabelten Promotorregionen 81
22.2 Bandshift Assays mit DIG-gelabelten Promotorregionen 82
22.2.1 Nichtradioaktive Markierung eines DNA-Fragments 82
22.2.2 Aufbereitung der DNA-Protein-Proben nach „DIG Gel Shift Kit, 2nd
Generation von Röche 82
22.2.3 Transfer der Proben auf eine Nylonmembran durch Kontaktblottmg 83
22.2.4 Immunologischer Nachweis der DIG-markierten DNA-Fragmente 83
23. Reverse Transkriptase - Polymeraseketteareaktion (RT-PCR) mit dem
Inhaltsverzeichnis
RNeasy Mini Kit (QIAGEN) 84
23.1 Anzucht der ApapRl-, ApapR2-, ApapR3apra-, ApapR4apm-,
ApapRSapra- bzw. A spAÄqpra-Deletionsmutante 84
23.2 RNA-Isolierung mit dem RNeasy Mini Kit (QIAGEN) 84
IV Ergebnisse 87
1. Komplettierung der Pristinamycin-Biosynthesegenregion 87
1.1 Charakterisierung des rechten Randes der Pristinamycin-Genregion 88
1.1.1 Konstruktion der Sonde „sre 89
1.1.2 Einsatz der Sonde „sre zur Isolierung von Cosmiden 89
1.1.3 Charakterisierung von Cosmiden mit Hilfe von Restriktions-,
PCR- und Southem-Blot-Experimenten 91
1.2 Identifizierung von zusätzlichen Pristinamycin-Biosynthesegenen 93
2. Untersuchungen zur Phenylglycin-Biosynthese 97
2.1 Heterologe Expression der Phenylglycin-Biosynthesegene 97
2.2 Konstruktion von Phenylglycinbiosynthese-Mutanten 99
2.2.1 Plasmidkonstruktionen zur Geninsertionsmutagenese 99
2.2.2 Nachweis der erfolgreichen Mutationen der Phenylglycingene
mittels PCR- uns Southern Blot-Experimenten 103
2.2.3 Untersuchungen der Pristinamycin-Biosynthese der Phenylglycin-
Mutanten 106
2.2.3.1 Kultivierungsbedingungen furPhenylglycin-Mutanten
zur Pristinamycin-Produktionsanalyse 106
2.2.3.2 Etablierung von Pristinamycin-Nachweisverfahren zur
Analyse von Phenylglycin-Mutanten 106
2.2.4 Einfluss der Mutation der putativen Phenylglycingene pgd,
pyhl, pyh2 bzw. pgt auf die Pristinamycin-Produktion 107
2.2.5 Chemische Komplementation der Phenylglycin-Mutanten
Apgdapra, Apyhlapra, Apyh2apra bzw. Apgtapra
durch Fütterungsexperimente 110
2.2.6 Einfluss der ?Äe-Mutation auf die Pristinamycin Produktion 115
2.2.6.1 Analyse der Pristinamycin-Produktion in der
Atheapra-Mutante 115
2.2.6.2 Analyse der Pristinamycin-Produktion in der
komplementierten Atheapm-Mntante 116
Inhaltsverzeichnis
2.2.6.2.1 Chemische Komplementation 116
2.2.6.2.2 Genetische Komplementation 116
2.2.7 Komplementation der Apgdapra- und zJ/?gtopra-Phenylglycin-
Mutante mit den homologen Dihydroxyphenylglycin-Genen
dpgC bzw. pgat aus Amycolatopsis balhimycina 120
2.2.7.1 Konstruktion von Plasmiden zur Komplementation i
der Apgdapra- und Apgtapra-Mutzate mit dpgC bzw. i
pgat aus A. balhimycina 122
2.2.7.2 Analyse der Pristinamycin-Produktion in der mit dpgC-
bzw.pgat-komptementierten Apgdapra- bzw. Apgtapra-
Mutante 123
3. Regulation der Pristinamycin-Biosynthese 125
3.1 In «7/co-Analyse der Regulatorsequenzen 126
3.2 Konstruktion von Pristinaraycin-Regulatormutanten 129
3.2.1 Plasmidkonstruktionen zur Geninsertionsmutagenese 130
3.2.2 Nachweis der erfolgreichen Mutationen der Regulatorgene mit
Hilfe von PCR- und Southern Blot-Experimenten 132
3.3 Phänotypische Charakterisierung der Regulator-Mutanten 136
3.4 Biochemische Charakterisierung der Regulator-Mutanten 138
3.4.1 Einfluss der Mutation der Regulatorgene auf die
Pristinamycin-Produktion 139
3.4.2 Genetische Komplementation der Regulatormutanten 141
3.4.2.1 Pristinamycin-Produktion des ApapR3apra (pYM17)-
Komplementationsstammes 142
3.4.2.2 Pristinamycin-Produktion der ApapR4apra-
Komplementationsstämme 143
3.4.2.2.1 Pristinamycin-Produktion des ApapR4apra (pYM18
Komplementationsstammes 143
3.4.2.2.2 Pristinamycin-Produktion des ApapR4apra
(pYM33)-Komplementationsstammes 143
3.4.2.2.3 Identifizierung vonpapiW-Cotranskript
mittels RT-PCR 146
3.4.2.2.4 Pristinamycin-Produktion des ApapR4apra
(pYM34)-Komplemeotationsstainmes 147
Inhaltsverzeichnis
3.4.2.3 Pristinamycin-Produktion des ApapR5apra (pYM19)-
Komplernentationsstammes 149
3.4.2.4 Pristinamycin-Produktion des AspbRapra (pYM20)-
Komplementationsstammes 150
3.4.2.5 Komplementationsversuche mit den SARPs PapRl,
PapR2 und PapR4 151
3.4.3 Homologe Expression vonpapR3, papR4, papR5 und spbR 154
3.4.3.1 Plasmidkonstruktionen zur homologen Expression von
papR3, papR4, papRS und spbR in S. pristinaespiralis 154
3.4.3.2 Einfluss derpapZU-Überexpression auf die
Pristinamycin-Biosynthese 156
3.4.3.3 Einfluss derpopiW-Überexpression auf die
Pristinamycin-Biosynthese 156
3.4.3.4 Einfluss der papRJ-Überexpression auf die
Pristinamycin-Biosynthese 157
3.4.3.5 Einfluss der ,s/?WJ-Überexpression auf die
Pristinamycin-Biosynthese 158
3.5 Untersuchungen zur Regulation mittels DNA-Protein-Interaktionsstudien 160
3.5.1 Heterologe Expression von papR3, papR4, papR5 und spbR 160
3.5.1.1 Plasmidkonstruktionen zur heterologen Expression von
papRS, papR4, papR5 und spbR 160
3.5.1.2 Heterologe Expression in E. coli BL21 161
3.5.1.3 Heterologe Expression in S. lividans T7 162
3.5.1.3.1 Expression mit pGM9/pRSETB-
Fusionskonstrukten 162
3.5.1.3.2 Expression mit pGM190-Konstrukten 164
3.5.2 Aufreinigung und Detektion von HisPapRl, HisPapR2,
HisPapR3, HisPapR4, HisPapR5 und HisSpbR 165
3.5.3 Charakterisierung von S. lividans (pGMl90/papR2) 167
3.5.4 Interaktionsstudien mit Pristinamycin-Regulatoren 169
3.5.4.1 In silico-Analyse putativer DNA-Bindesequenzen
der Regulatoren 169
3.5.4.2 DNA-Protein-Interaktionsstudien mittels Bandshift-
Assays 174
Inhaltsverzeichnis
3.5.4.2.1 Amplifikation von Promotorregionen 175
3.5.4.2.2 Bandshift-Assays mit Lysaten von S. lividans
(pGM190), (pGMl90/papRJ), ( pGM190/papR2
(pYM17), (pYM18), (pYM19) sowie (pYM20)
und Promotorregionen von Regulatorgenen 177
3.5.4.2.3 Bandshift-Assays mit y-Butyrolacton 181
3.5.4.2.4 Bandshift-Assays mit Lysaten der heterologen
Expression der Regulatoren und
Promotorregionen von
Pristinamycin-Strukturgenen 183
3.5.4.2.5 Bandshift-Assays mit Lysaten der
Regulator-Mutanten und Promotorregionen
von Regulatorgenen 183
3.6 Untersuchungen zur Regulation auf transkriptionaler Ebene mittels
RT-PCR-Experimenten 185
3.6.1 Untersuchung der Pristinamycin-Produktion im Wildtyp und den
Regulatormutanten mittels HPLC zum Vergleich filr
RT-PCR-Experimente 186
3.6.2 RNA-Isolierung ftr RT-PCR-Experimente 187
3.6.3 RT-PCR-Experimente 188
3.6.3.1 RT-PCR mit dem S. pristinaespiralis-WMtyp 188
3.6.3.1.1 Analyse der •spfcÄ-Transkription
im S. pristinaespimlis-Wildtyp 189
3.6.3.1.2 Analyse derpapRl-Transkription
im S. pristinaespimlis-Wildtyp 189
3.6.3.1.3 Analyse der/MtpÄ?-Transkription
im S. pristinaespiralis-Wüätyf 190
3.6.3.1.4 Analyse der/x^pRi-Transkription
im S. pristinaespiralis-Wüdtyp 190
3.6.3.1.5 Analyse derp^iW-Transkription
im S. pristinaespiralis-Wüdtyp 190
3.6.3.1.6 Analyse derpapÄ5-Transkription
im 5. pristinaespiralis-WMtyp 191
l
Inhaltsverzeichnis
j 3.6.3,1.7 Analyse der Pristinamycin-
Strukturgentranskription im
S. pristinaespiralis-Wildtyp 192
; 3.6.3.2 RT-PCR mit der ApapRl -Mutante 193
3.6.3.3 RT-PCR mit der ApapR2 -Mutante 194
3.6.3.4 RT-PCRmit der ApapR3apra-Mutsnte 196
3.6.3.5 RT-PCR mit der ApapR4apra-Mutaate 197
3.6.3.6 RT-PCR mit der ApapR5apra-Mutante 198
3.6.3.7 RT-PCR mit der AspbRapra-Mutante 199
V Diskussion 201
1. Die Pristinamy cin-Biosynthesegenregion 201
1.1 Modell zu Pristinamy ein II-Biosynthese 202
1.2 Charakterisierung der Pristinamycin-Biosynthesegenregion 205
2. Untersuchungen zur Phenylglycin-Biosynthese 211
2.1 Phenylglycin-Biosynthese 211
2.2 Das mbtH-Shnliche Gen mbtY 214
2.3 Kreuzkomplementationen mit Balhimycingenen 215
3. Regulation der Pristinamycin-Biosynthese 218
3.1 Verschiedene Aspekte der Pristinamycin-Regulation 218
Das 30:70-Konzentrationsverhältnis von Pristinamvcin I: II 218
Komplementationsversuche mit den Pristinamvcin-SARPs PapRl. PapR2
undPapR4 218
Expressionsversuche mit SARPs in heterologen Stammen 219
Experimentelle Ansätze zur Aufklärung der Regulation der
Pristinamvcm-Biosvnthese 220
Aufreinigung und Charakterisierung des S. pristinaespiralis-v-Bxitvrolactons 221
3.2 Regulatoren der Pristinamycin-Biosynthesegenregion 222
Pristinarnycin-Regulator: SpbR 222
Pristinamycin-Regulator: PapRl 224
Pristinamyein-Regulator: PapR2 225
Pristinamycin-Regulator: PapR3 225
Pristinamycin-Regulator: PapR4 226
Pristinamycin-Regulator: PapR5 228
Putativer Pristinamycin-Regulator: PapR6 228
^ Inhaltsverzeichnis
Putativer Regulator der Mutactin-ähnlichen Biosynthese: Reg 230
3.3 Modell zur Regulation der Pristinamycin-Biosynthese im Vergleich zur
Tylosin-, Virginiamycin- und Lankamycin- bzw. Lankacidin-Biosynthese 231
VI Literatur 241
VII Anhang 264
1. Primer 264
1.1 Primer zu Erzeugung von Deletionskonstrukten 264
1.2 Primer zum Nachweis von Mutationen 265
1.3 Primer zur Erzeugung von Komplementationskonstrukten 265
1.4 Primer zur Erzeugung von Überexpressionskonstrukten 266
1.5 Primer zur Amplifikation von Promotorbereichen 266
1.6 Primer zur Amplifikation von cDNA (RT-PCR) 268
2. Erzeugte Bakterienstämme 269
2.1 Mutantenstamme 269
2.2 Komplementationsstämme 269
2.3 Expressionsstämme 271
3. Konstruierte Plasmide 272
3.1 Plasmide zur Mutantenerzeugung 272
3.2 Plasmide zur Komplementation von Mutanten 272
3.3 Plasmide zur Expression von Regulatorproteinen 273
4. Plasmidkarten 274
4.1 Plasmidkarten: Mutantenerzeugung 274
4.2 Plasmidkarten: Komplementation von Mutanten 276
4.3 Plasmidkarten: Expression von Regulatorproteinen 277
5. Häufig verwendete Abkürzungen 281
5.1 Allgemeine Abkürzungen 281
5.2 Abkürzungen für Gene und Proraotoren 283
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