Experimentelle Untersuchungen zur Expression des Gap-junction-Gens Konnexin43 in in vivo und in vitro produzierten präimplantatorischen Rinderembryonen mit Hilfe der Reversen Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR):
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1995
|
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1
EINLEITUNG
.
1
2
SCHRIFTTUM
.
4
2.1
ENTWICKLUNGSVORGAENGE
BEI
SAEUGEROOZYTEN
UND
PRAEIMPLANTATORISCHEN
EMBRYONEN
.
4
2.1.1
ENTWICKLUNG
UND
REIFUNG
VON
SAEUGEROOZYTEN
.
4
2.1.2
BEFRUCHTUNG
.
7
2.1.3
FRUEHE
EMBRYONALENTWICKLUNG
BEI
SAEUGEREMBRYONEN
.
8
2.1.3.1
KOMPAKTIERUNG
.
11
2.1.3.2
KAVITATION
UND
EXPANSION
.
12
2.1.4
VERGLEICHENDE
ASPEKTE
IN
VIVO
UND
IN
VITRO
PRODUZIERTER
EMBRYONEN
.
14
2.1.4.1
MATURATION
UND
FERTILISIERUNG
.
14
2.1.4.2
ENTWICKLUNG
VON
DER
ZYGOTE
BIS
ZUR
BLASTOZYSTE
.
15
2.1.4.3
NACHKOMMEN
.
17
2.2
GENEXPRESSION
.
19
2.2.1
GENEXPRESSION
BEI
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
.
19
2.2.1.1
TRANSKRIPTION
.
19
2.2.1.1.1
ABLAUF
DER
TRANSKRIPTION
.
19
2.2.1.1.2
POSTTRANSKRIPTIONALE
MODIFIKATIONEN
.
21
2.2.1.2
TRANSLATION
.
23
2.2.1.2.1
ABLAUF
DER
TRANSLATION
.
23
2.2.1.2.2
POSTTRANSLATIONALE
MODIFIKATIONEN
.
25
2.2.1.3
REGULATION
DER
GENEXPRESSION
.
25
2.2.2
NACHWEISMOEGLICHKEITEN
DER
GENEXPRESSION
.
28
2.2.2.1
ALLGEMEINE
BESCHREIBUNG
DER
METHODEN
ZUM
NACHWEIS
VON
MRNA
.
29
2.2.3.
REVERSE
TRANSKRIPTASE
POLYMERASEKETTENREAKTION
(RT-PCR)
.
31
2.2.3.1
REVERSE
TRANSKRIPTION
(RT)
.
32
2.2.3.2
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
.
33
2.2.3.2.
1
PRIMERDESIGN
FUER
DIE
PCR
.
35
2.2.3.2.2
BEEINFLUSSUNG
DER
EFFIZIENZ
DER
PCR
DURCH
DIE
REAKTIONSPARAMETER
.
36
2.2.3.2.3
DAS
PROBLEM
DER
KONTAMINATION
.
38
2.2.4
GENEXPRESSION
BEI
PRAEIMPLANTATORISCHEN
EMBRYONEN
.
39
2.2.4.1
AKTIVIERUNG
DES
EMBRYONALEN
GENOMS
.
39
2.2.4.2
EXPRESSION
EINZELNER
GENE
.
43
2.2.4.2.
1
GENE
MIT
NUKLEAEREN
FUNKTIONEN
.
43
2.2A.2.2
GENE,
DIE
FUER
ELEMENTE
DES
ZYTOSKELETTS
KODIEREN
.
44
2.2.4.2.3
FUER
MEMBRANKANAELE
UND
LONENTRANSPORTER
KODIERENDE
GENE
.
45
2.2.4.2.4
GENE,
DIE
FUER
ZELLOBERFLAECHENPROTEINE
ODER
SEZEMIERTE
PROTEINE
KODIEREN
.
45
2.2.4.2.5
GENE,
DIE
FUER
WACHSTUMSFAKTOREN
UND
DEREN
REZEPTOREN
KODIEREN
(EINSCHLIESSLICH
HORMONE
UND
MHC)
.
46
2.2.4.2.6
GENE,
DIE
FUER
HAUSHALTSFUNKTIONEN
KODIEREN
.
47
2.2.4.2.7
GENE,
DIE
MIT
ENDOGENEN
RETROVIREN
ASSOZIIERT
SIND
.
48
2.3
ZELLKONTAKTE
BEI
OOZYTEN
UND
PRAEIMPLANTATORISCHEN
EMBRYONEN
.
55
2.3.1
ZELLADHAESION
.
55
2.3.2
INTERZELLULAERE
VERBINDUNGEN
.
56
2.3.2.1
ZYTOPLASMATISCHE
BRUECKEN
.
56
2.3.2.2
DESMOSOMEN
.
57
2.3.2.3
TIGHT
JUNCTIONS
.
57
2.3.3
BEDEUTUNG
DER
ZELLKONTAKTE
WAEHREND
DER
OOZYTENREIFUNG
.
57
2.3.4
BEDEUTUNG
DER
ZELLKONTAKTE
WAEHREND
DER
EMBRYONALEN
FRUEHENTWICKLUNG
.
59
2.4
GAP
JUNCTIONS
.
62
2.4.1
MORPHOLOGISCHER
AUFBAU
DER
GAP
JUNCTIONS
.
62
2.4.2
BIOCHEMISCHER
UND
MOLEKULARBIOLOGISCHER
AUFBAU
DER
GAP
JUNCTIONS
.
63
2.4.2.1
TOPOLOGISCHE
STRUKTUR
DER
KONNEXINE
.
63
2.4.2.2
KONNEXIN-MULTIGENFAMILIE
.
64
2.4.2.3
STRUKTUR
DER
KONNEXIN-GENE
.
68
2.4.3
FUNKTIONEN
DER
KONNEXINE
.
70
2.4.4
REGULATION
DER
KONNEXINE
.
70
2.4.4.1
REGULATION
DER
EXPRESSION
DER
KONNEXINE
.
70
2.4.4.2
REGULATION
DER
FUNKTION
DER
KONNEXINE
.
72
3
MATERIAL
UND
METHODEN
.
74
3.1
IN
VIVO-EMBRYONEN
(MAUS
UND
RIND)
.
74
3.1.1
MEDIENHERSTELLUNG
.
74
3.1.1.1
PBS
.
74
3.1.1.2
PRONASE-LOESUNG
.
74
3.1.2
TIERMATERIAL
.
74
3.1.2.1
MAEUSE
.
74
3.1.2.2
RINDER
.
75
3.1.3
SUPEROVULATIONSBEHANDLUNG
.
75
3.1.3.1
SUPEROVULATIONSBEHANDLUNG
BEI
DER
MAUS
.
75
3.1.3.2
SUPEROVULATIONSBEHANDLUNG
BEIM
RIND
.
75
3.1.4
GEWINNUNG
DER
EMBRYONEN
.
75
3.1.4.1
GEWINNUNG
DER
EMBRYONEN
BEI
DER
MAUS
.
75
3.1.4.2
GEWINNUNG
DER
EMBRYONEN
BEIM
RIND
.
76
3.1.5
MORPHOLOGISCHE
BEURTEILUNG
DER
EMBRYONEN
.
76
3.2
IN
VITRO-PRODUKTION
VON
RINDEREMBRYONEN
(TVP)
.
80
3.2.1
MEDIENPRAEPARATION
.
80
3.2.1.1
PBS
.
80
3.2.1.2
SAMMELMEDIUM
FUER
KOKS
(KUMULUS-OOZYTEN-KOMPLEXE)
.
80
3.2.1.3
BASISMEDIUM
FUER
DIE
IN
VITRO-REIFUNG
UND
-KULTUR
VON
RINDEREMBRYONEN
.
80
3.2.1.4.
ZUSAETZE
ZUM
BASISMEDIUM
FUER
DIE
IN
VITRO-REIFUNG
SOWIE
-KULTUR
VON
RINDEREMBRYONEN
.
80
3.2.1.4.1
HORMONE
.
80
3.2.1.4.2
OESTRISCHES
KUHSERUM
(OCS)
.
81
3.2.1.5
FERTILISIERUNGSMEDIEN
.
81
3.2.1.5.1
ZUSATZSTOFFE
ZUR
SPERMIENKAPAZITATION
.
82
3.2.2
KUMULUSENTFEMUNG,
FIXATION
UND
FAERBUNG
.
83
3.2.3
GEWINNUNG
DER
OVARIEN
.
83
3.2.4
OOZYTENISOLIERUNG
.
83
3.2.5
OOZYTENKLASSIFIZIERUNG
.
84
3.2.6
IN
VITRO-REIFUNG
(IN
VITRO
MATURATION,
IVM)
.
85
3.2.6.1
BESTIMMUNG
DER
REIFUNGSRATE
.
85
3.2.7
IN
VITRO-FERTILISIERUNG
(IN
VITRO
FERTILIZATION,
IVF)
.
86
3.2.7.1
SPERMIENVORBEREITUNG
.
86
3.2.7.2
BESTIMMUNG
DER
FERTILISIERUNGSRATE
.
87
3.2.8
IN
VITRO-KULTIVIERUNG
DER
ZYGOTEN
(IN
VITRO
CULTURE,
IVC)
.
88
3.2.8.1
MORPHOLOGIE
DER
UNTERSUCHTEN
STADIEN
.
89
3.2.8.2
BESTIMMUNG
DER
ENTWICKLUNGSRATEN
.
93
3.3
NACHWEIS
DES
KONNEXIN43-(CONNEXIN43-,
CX43-)GENS
MIT
HILFE
DER
PCR
.
93
3.3.1
EXTRAKTION
DER
DNA
.
93
3.3.1.1
PRAEPARATION
DER
VERWENDETEN
LOESUNGEN
.
93
3.3.1.2
DURCHFUEHRUNG
DER
DNA-EXTRAKTION
AUS
GEWEBE
.
93
3.3.1.3
DURCHFUEHRUNG
DER
DNA-EXTRAKTION
AUS
EMBRYONEN
.
94
3.3.2
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
.
94
3.3.2.1
VORBEREITUNG
DES
ARBEITSMATERIALS
.
94
3.3.2.2
VERWENDETE
LOESUNGEN
UND
REAGENZIEN
.
95
3.3.2.3
HERSTELLUNG
DER
REAKTIONSGEMISCHE
(MASTERMIX,
MM)
FUER
DIE
PCR
.
98
3.3.2.4
TEMPERATURABLAEUFE
WAEHREND
DER
PCR
.
99
3.4
NACHWEIS
DER
MRNA-EXPRESSION
DES
KONNEXIN43-GENS
MIT
HILFE
DER
RT-PCR
.
99
3.4.1.
EXTRAKTION
DER
RNA
.
99
3.4.1.1
VERWENDETE
LOESUNGEN
UND
REAGENZIEN
.
100
3.4.1.1.1
LOESUNGEN
ZUR
RNA-EXTRAKTION
AUS
GEWEBE
.100
3.4.1.1.2
LOESUNGEN
ZUR
RNA-EXTRAKTION
AUS
EMBRYONEN
.
101
3.4.1.2
DURCHFUEHRUNG
DER
RNA-EXTRAKTION
AUS
GEWEBE
.
101
3.4.1.3
DURCHFUEHRUNG
DER
RNA-EXTRAKTION
AUS
EMBRYONEN
.
102
3.4.2
UEBERPRUEFUNG
DER
INTAKTHEIT
DER
RNA
.
102
3.4.2.1
BENOETIGTE
LOESUNGEN
UND
REAGENZIEN
.
104
3.4.2.2
DURCHFUEHRUNG
DER
UEBERPRUEFUNG
DER
INTAKTHEIT
DER
RNA
.
105
3.4.3
REVERSE
TRANSKRIPTASE-POLYMERASEKETTENRCAKTION
(RT-PCR)
.
106
3.4.3.1
VERWENDETE
LOESUNGEN
UND
REAGENZIEN
.
106
3.4.3.2
REVERSE
TRANSKRIPTION
(RT)
.
106
3.4.3.2.1
VORBEREITUNG
DER
PROBEN
.
106
3.4.3.2.2
HERSTELLUNG
DER
REAKTIONSGEMISCHE
FUER
DIE
REVERSE
TRANSKRIPTION
(RT)
.
107
3.4.3.2.3
ABLAUF
DER
REVERSEN
TRANSKRIPTION
(RT)
.
108
3.4.3.3
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
NACH
REVERSER
TRANSKRIPTION
(RT)
.
108
3.5
VERIFIKATION
DER
PCR
BZW.
RT-PCR-PRODUKTE
.
108
3.6
VERWENDETE
KONTROLLEN
UND
DNA-LAENGENSTANDARDS
.
109
3.6.1
KONTROLLEN
IN
DER
PCR
.
109
3.6.2
KONTROLLEN
IN
DER
RT-PCR
.
109
3.6.3
VERWENDETE
DNA-LAENGENSTANDARDS
.
HO
3.7
DARSTELLUNG
DER
PCR
UND
RT-PCR-PRODUKTE
MIT
HILFE
DER
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
111
3.7.1
VERWENDETE
REAGENZIEN
UND
LOESUNGEN
.
111
3.7.2
DURCHFUEHRUNG
DER
ELEKTROPHORESE
.
112
3.8
ALLGEMEINER
VERSUCHSABLAUF
.
112
3.9
VERSUCHSANORDNUNG
.
115
3.9.1
VERSUCHE
ZUR
OPTIMIERUNG
DER
PCR-PARAMETER
.
115
3.9.1.1
OPTIMIERUNG
DER
PCR-PARAMETER
FUER
MAUS-KONNEXIN43
(VERSUCH
1)
.
115
3.9.1.2
OPTIMIERUNG
DER
PCR-PARAMETER
FUER
RIND-KONNEXIN43
BEI
DEN
BEIDEN
EINGESETZTEN
PRIMERPAAREN
(VERSUCHE
2
UND
3)
.
116
3.9.1.3
OPTIMIERUNG
DER
PCR-PARAMETER
FUER
RIND-METALLOTHIONEIN
(VERSUCH
4)
.
116
3.9.2
VERSUCHE
ZUR
DARSTELLUNG
DES
KONNEXIN43-GENS
MIT
HILFE
DER
PCR
.
117
3.9.2.1
DARSTELLUNG
DES
KONNEXIN43-GENS
IN
MAEUSEHERZ
UND
-LEBER
(VERSUCH
5)
SOWIE
IN
MAEUSEEMBRYONEN
(VERSUCH
6)
MIT
HILFE
DER
PCR
.
117
3.9.2.2
DARSTELLUNG
DES
KONNEXIN43-GENS
IN
RINDERHERZ
UND
-LEBER
(VERSUCH
7)
SOWIE
IN
RINDEREMBRYONEN
(VERSUCH
8)
MIT
HILFE
DER
PCR
.
117
3.9.3
VERSUCHE
ZUR
DARSTELLUNG
DER
MRNA-EXPRESSION
DES
KONNEXIN43-GENS
MIT
HILFE
DER
RT-PCR
.
117
3.9.3.1
DARSTELLUNG
DER
MRNA-EXPRESSION
DES
KONNEXIN43-GENS
IN
MAEUSEHERZ
UND
-LEBER
(VERSUCH
9)
MIT
HILFE
DER
RT-PCR
.
117
3.9.3.2
DARSTELLUNG
DER
MRNA-EXPRESSION
DES
KONNEXIN43-GENS
IN
IN
VIVO
GEWONNENEN
MAEUSEEMBRYONEN
(VERSUCH
10)
MIT
HILFE
DER
RT-PCR
.
118
3.9.3.3
DARSTELLUNG
DER
MRNA-EXPRESSION
DES
KONNEXIN43-GENS
IN
RINDERHERZ
UND
-LEBER
(VERSUCH
11)
MIT
HILFE
DER
RT-PCR
.
118
3.9.3.4
DARSTELLUNG
DER
MRNA-EXPRESSION
DES
KONNEXIN43-GENS
IN
IN
VITRO
GEWONNENEN
RINDEROOZYTEN
UND
-EMBRYONEN
(VERSUCH
12)
MIT
HILFE
DER
RT-PCR
.
118
3.9.3.5
DARSTELLUNG
DER
MRNA-EXPRESSION
DES
KONNEXIN43-GENS
IN
IN
VIVO
GEWONNENEN
RINDEREMBRYONEN
(VERSUCH
13)
MIT
HILFE
DER
RT-PCR
.
119
3.9.4
VERSUCHE
ZUR
VERIFIKATION
DER
PCR
BZW.
RT-PCR
PRODUKTE
(VERSUCHE
14A-14D)
.
119
3.10
STATISTISCHE
AUSWERTUNG
.
119
4
ERGEBNISSE
.
121
4.1
4.1.1
VERSUCHE
ZUR
OPTIMIERUNG
DER
PCR-PARAMETER
.
122
VERSUCH
1:
OPTIMIERUNG
DER
PCR-PARAMETER
FUER
MAUS-KONNEXIN43
.
122
4.1.2
VERSUCHE
2
UND
3:
OPTIMIERUNG
DER
PCR-PARAMETER
FUER
RIND-KONNEXIN43
BEI
DEN
BEIDEN
EINGESETZTEN
PRIMERPAAREN
.
124
4.1.3
VERSUCH
4:
OPTIMIERUNG
DER
PCR-PARAMETER
FUER
RIND-METALLOTHIONEIN
.
127
4.2
VERSUCHE
ZUR
DARSTELLUNG
DES
KONNEXIN43-GENS
MIT
HILFE
DER
PCR
.
127
4.2.1
VERSUCHE
5
UND
6:
DARSTELLUNG
DES
KONNEXIN43-GENS
IN
MAEUSEHERZ
UND
-LEBER
SOWIE
IN
MAEUSEEMBRYONEN
MIT
HILFE
DER
PCR
.
127
4.2.2
VERSUCHE
7
UND
8:
DARSTELLUNG
DES
KONNEXIN43-GENS
IN
RINDERHERZ
UND
-LEBER
SOWIE
IN
RINDEREMBRYONEN
MIT
HILFE
DER
PCR
.
129
4.3
VERSUCHE
ZUR
DARSTELLUNG
DER
MRNA-EXPRESSION
DES
KONNEXIN43-GENS
MIT
HILFE
DER
RT-PCR
.
130
4.3.1
VERSUCH
9:
DARSTELLUNG
DER
MRNA-EXPRESSION
DES
KONNEXIN43-GENS
IN
MAEUSEHERZ
UND
-LEBER
MIT
HILFE
DER
RT-PCR
.
130
4.3.2
VERSUCH
10:
DARSTELLUNG
DER
MRNA-EXPRESSION
DES
KONNEXIN43-GENS
IN
IN
VIVO
GEWONNENEN
MAEUSEEMBRYONEN
MIT
HILFE
DER
RT-PCR
.
132
4.3.3
VERSUCH
11:
DARSTELLUNG
DER
MRNA-EXPRESSION
DES
KONNEXIN43-GENS
IN
RINDERHERZ
UND
-LEBER
MIT
HILFE
DER
RT-PCR
.
134
4.3.4
VERSUCH
12:
DARSTELLUNG
DER
MRNA-EXPRESSION
DES
KONNEXIN43-GENS
IN
IN
VITRO
GEWONNENEN
RINDEROOZYTEN
UND
-EMBRYONEN
MIT
HILFE
DER
RT-PCR
.
135
4.3.5
VERSUCH
13:
DARSTELLUNG
DER
MRNA-EXPRESSION
DES
KONNEXIN43-GENS
IN
IN
VIVO
GEWONNENEN
RINDEREMBRYONEN
MIT
HILFE
DER
RT-PCR
.
139
4.4
VERSUCHE
14A-14D:
VERSUCHE
ZUR
VERIFIKATION
DER
PCR
BZW.
RT-PCR-PRODUKTE
.
140
5
DISKUSSION
.
141
5.1
DIE
RT-PCR
ALS
NACHWEISMETHODE
DER
MRNA-EXPRESSION
BEI
PRAEIMPLANTATORISCHEN
EMBRYONEN
.
142
5.2
UNTERSCHIEDE
IN
DER
GENEXPRESSION
BEI
IN
VIVO
UND
IN
VITRO
PRODUZIERTEN
EMBRYONEN
UNTER
BESONDERER
BERUECKSICHTIGUNG
DER
GAP
JUNCTION-GENE
.
146
5.3
SCHLUSSFOLGERUNGEN
.
151
6
ZUSAMMENFASSUNG
.
153
7
SUMMARY
.
156
8
LITERATURVERZEICHNIS
.
159
9
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
224 |
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