DNA-Immunisierung gegen die Aujeszkysche Krankheit:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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1997
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
.
13
2.
LITERATURUEBERSICHT
2.1.
DIE
AUJESZKYSCHE
KRANKHEIT
.
15
2.2.
DNA-IMMUNISIERUNG
.
27
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
3.1.
MATERIAL
.
34
3.1.1.
VERSUCHSTIERE
.
34
3.1.1.1.
MAEUSE
.
34
3.1.1.2.
SCHWEINE
.
34
3.1.2.
ZELLEN,
BAKTERIEN,
PLASMIDE,
VIMSSTAEMME
UND
VIRUSANTIGEN
.
34
3.1.2.1.
ZELLEN
.
34
3.1.2.2.
BAKTERIEN
.
35
3.1.2.3.
PLASMIDE
.
35
3.1.2.4.
VIREN
.
35
3.1.2.5.
DURCH
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
GEREINIGTES
GLYKOPROTEIN
GC
.
35
3.1.3.
ANTIKOERPER
.
36
3.1.4.
ENZYME
UND
ENZYMKONJUGATE
.
36
3.1.5.
SEREN,
ANTIBIOTIKA
UND
MEDIEN
FUER
DIE
ZELLKULTUR
.
37
3.1.5.1.
SEREN
.
37
3.1.5.2.
ANTIBIOTIKA
.
37
3.1.5.3.
MEDIEN
.
37
3.1.6.
LOESUNGEN
UND
PUFFER
.
38
3.1.7.
CHEMIKALIEN
.
46
3.1.8.
KITS
.
48
3.1.9
NUKLEINSAEUREN
.
48
3.1.10.
RADIOCHEMIKALIEN
.
48
3.1.11.
PLASTIKWAREN
FUER
DIE
ZELLKULTUR
.
48
3.1.12.
GERAETE
UND
LABORHILFSMITTEL
.
49
3.1.13
VERBRAUCHSMATERIAL
.
51
3.2.
METHODEN
3.2.1.
TIERVERSUCHE
.
53
3.2.1.1.
VERSUCHE
MIT
MAEUSEN
.
53
3.2.1.1.1.
HALTUNG
DER
MAEUSE
.
53
3.2.1.1.2.
IMMUNISIERUNG,
BLUTENTNAHME
UND
EUTHANASIE
.
53
3.2.1.2.
VERSUCHE
MIT
SCHWEINEN
.
54
3.2.I.2.I.
HALTUNG
DER
TIERE
.
54
3.2.I.2.2.
IMMUNISIERUNG
DER
TIERE
.
54
3.2.1.2.3.
BLUTENTNAHME
.
54
3.2.I.2.4.
BLUTAUFARBEITUNG
.
55
3.2.I.2.5.
INFEKTION
DER
TIERE,
KLINISCHE
BEOBACHTUNG
UND
EUTHANASIE
.
55
3.2.I.2.6.
ENTNAHME
VON
NASENTUPFEM
.
55
3.2.1.2.7.
SEKTION
DER
TIERE
.
56
3.2.2.
HERSTELLUNG
DER
PLASMID-DNA,
KLONIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
56
3.2.2.1.
SPALTUNG
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
56
3.2.2.2.
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
VON
DNA
.
56
3.2.2.3.
ELUTION
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
.
57
3.2.2.3.I.
ELUTION
IM
DIALYSESCHLAUCH
.
57
32.2.3.2.
ELUTION
MIT
QUIAQUICK
.
58
3.2.2.4.
PHENOLEXTRAKTION
UND
ETHANOLPRAEZIPITATION
VON
DNA
.
58
3.2.2.5.
DEPHOSPHORYLIERUNG
FREIER
DNA-ENDEN
.
59
3.2.2.6.
LIGATION
.
59
3.2.2.7.
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
MIT
PLASMID-DNA
.
59
3.2.2.7.I.
HERSTELLUNG
TRANSFORMATIONSKOMPETENTER
BAKTERIEN
.
59
3.2.2.7.2.
TRANSFORMATION
.
60
3.2.2.8.
IDENTIFIZIERUNG
POSITIVER
BAKTERIENKLONE
.
61
3.2.2.8.1.
PLASMID-DNA-SCHNELLTEST
.
61
3.2.2.8.2.
KOLONIEFILTERHYBRIDISIERUNG
.
61
3.2.2.9.
IDENTIFIZIERUNG
MITTELS
FARBTEST
(YYBLAU/WEISS-UNTERSCHEIDUNG
"
)
.
62
3.2.2.10.
EINFRIEREN
UND
AUFTAUEN
VON
BAKTERIEN
.
62
3.2.2.1
1.
GROSSANZUCHT
UND
REINIGUNG
VON
PLASMID-DNA
.
63
3.2.2.11.1.
PLASMIDISOLIERUNG
.
63
3.2.2.11.1.1.
QUIAGEN-METHODE
.
63
3.2.2.11.1.2.
CAESIUMCHLORID-METHODE
.
64
3.2.2.12.
HERSTELLEN
DES
IMPFMATERIALS
.
65
3.2.3.
ZELLKULTUR
.
65
3.2.3.1.
ANZUCHT
VON
ZELLEN
.
65
3.2.3.2.
INFEKTION
VON
ZELLEN
.
66
3.2.3.3.
VIRUSANZUCHT
.
66
3.2.3.4.
TITRATION
VON
VIRUSSUSPENSIONEN
(PLAQUETEST)
.
66
3.2.3.5.
REINIGUNG
VON
VIRIONEN
.
67
3.2.3.6.
EXTRAKTION
VIRALER
GLYKOPROTEINE
.
67
3.2.3.7.
TRANSFEKTION
.
68
3.2.3.8.
FIXIERUNG
DER
ZELLEN
FUER
IMMUNFLUORESZENZ
.
68
3.2.3.8.1.
FIXIERUNG
MIT
PARAFORMALDEHYD
.
68
3.2.3.8.2.
FIXIERUNG
MIT
ACETON/
METHANOL
.
69
3.2.4.
METHODEN
ZUM
NACHWEIS
DER
TRANSIENTEN
EXPRESSION
.
69
3.2.4.1.
INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZ
.
69
3.2.4.2.
RADIOIMMUNPRAEZIPITATION
(RIP)
.
69
3.2.4.2.I.
METABOLISCHE
MARKIERUNG
DER
PROTEINE
MIT
35
S-METHIONIN/
CYSTEIN
.
70
3.2.4.2.2.
VORBEREITUNG
DER
STAPHYLOCOCCUS
AUREUS-SUSPENSION
.
70
3.2.4.23.
IMMUNPRAEZIPITATION
.
71
3.2.4.2.4.
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
71
3.2.4.2.5.
FLUOROGRAFIE
.
72
3.2.4.3.
NACHWEIS
DER
SS-GALAKTOSIDASEAKTIVITAET
.
72
3.2.5.
HISTOCHEMISCHER
NACHWEIS
DER
SS-GALAKTOSIDASEAKTIVITAET
IN
GEWEBEN
.
72
3.2.5.I.
ENTNAHME
UND
PRAEPARATION
DER
ORGANE
.
72
3.2.5.2.
PRAEPARATION
FUER
PARAFFINSCHNITTE
.
73
3.2.5.3.
PRAEPARATION
FUER
KRYOSTATSCHNITTE
.
73
3.2.6.
ANTIKOERPEMACHWEIS
.
74
3.2.6.1.
WESTERN
BLOT
.
74
3.2.6.1
.1.
PROBENPRAEPARATION
FUER
WESTERN
BLOT
.
74
3.2.6.1.2.
WESTERN
BLOT
.
74
3.2.6.I.3.
DETEKTION
DER
PROTEINE
AUF
DER
NITROZELLULOSE
.
75
3.2.6.2.
PLAQUEREDUKTIONSTEST
.
75
3.2.6.3.
ELISA
.
76
3.2.7.
METHODEN
ZUM
NACHWEIS
DER
ZELLULAEREN
IMMUNANTWORT
.
77
3.2.7.1.
ISOLIERUNG
PERIPHERER
MONONUKLEAERER
ZELLEN
DES
BLUTES
(PBMC)
.
77
3.2.7.2.
BESTIMMUNG
DER
ZELLZAHL
.
78
3.2.7.3.
EINFRIEREN
UND
LAGERUNG
VON
ZELLEN
.
78
3.2.7.4.
AUFTAUEN
VON
ZELLEN
.
78
3.2.7.5.
UV-INAKTIVIERUNG
VON
PRV
.
79
3.2.7.OE.
PROLIFERATIONSTEST
.
79
4.
ERGEBNISSE
4.1.
HERSTELLUNG
DER
EXPRESSIONSPLASMIDE
.
80
4.1.1.
KLONIERUNG
DES
PLASMIDS
GB-CMV
.
80
4.1.2.
KLONIERUNG
DES
PLASMIDS
GC-CMV
.
81
4.1.3.
KLONIERUNG
DES
PLASMIDS
GDGL-CMV
.
81
4.1.4.
KLONIERUNG
DES
PLASMIDS
GD-CMV
.
81
4.1.5.
KLONIERUNG
DES
PLASMIDS
LACZ-CMV
.
82
4.2.
NACHWEIS
DER
TRANSIENTEN
EXPRESSION
IN
ZELLKULTUR
.
83
4.2.1.
NACHWEIS
MITTELS
INDIREKTER
IMMUNFLUORESZENZ
.
84
4.2.2.
NACHWEIS
DER
EXPRESSION
DURCH
RADIOIMMUNPRAEZIPITATION
.
85
4.2.3.
NACHWEIS
DER
EXPRESSION
DER
SS-GALAKTOSIDASE
.
87
4.3.
UNTERSUCHUNGEN
IN
DER
MAUS
.
88
4.3.1.
EXPRESSION
DER
SS-GALAKTOSIDASE
.
88
4.3.2.
IMMUNISIERUNG
VON
MAEUSEN
MIT
GDGL-CMV
.
92
4.3.3.
IMMUNISIERUNG
VON
MAEUSEN
MIT
GB-CMV,
GC-CMV
UND
GD-CMV
.
96
4.3.4.
EINFLUSS
VON
APPLIKATIONSWEG
UND
WIEDERHOLUNGSIMPFUNGEN
.
99
4.3.5.
DAUER
DER
NACHWEISBAREN
ANTIKOERPERANTWORT
.
104
4.4.
UNTERSUCHUNGEN
IM
SCHWEIN
4.4.1.
INDUKTION
DER
HUMORALEN
IMMUNANTWORT
.
106
4.4.1.1.
EINFLUSS
DER
APPLIKATIONSROUTE
UND
DER
DNA-MENGE
.
114
4.4.2.
INDUKTION
DER
ZELLVERMITTELTEN
IMMUNANTWORT
.
118
4.4.2.1
STIMULIERUNG
DER
PBMC
MIT
UV-INAKTIVIERTEM
VIRUS
.
119
4.4.3.
DAUER
DER
NACHGEWIESENEN
IMMUNANTWORT
.
120
4.4.4.
SCHUTZWIRKUNG
DER
DNA-VAKZINE
GEGEN
BELASTUNGSINFEKTION
.
123
4.4.4.1.
INFEKTION
MIT
NIA-3
.
124
4.4.4.2.
EINFLUSS
DER
DNA-MENGE
UND
DER
APPLIKATIONSROUTE
.
127
4.4.4.3.
INFEKTION
MIT
75V19
.
130
5.
DISKUSSION
.
134
6.
ZUSAMMENFASSUNG
.
145
7.
SUMMARY
.
147
8.
LITERATURVERZEICHNIS
.
149
9.
ANHANG
VEROEFFENTLICHUNGEN
.
169
LEBENSLAUF.
.
170
DANKSAGUNG
.
171 |
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