Experimentelle Untersuchungen zur Bedeutung von Platelet-derived growth factor (PDGF) in der frühen Embryonalentwicklung von Rinderembryonen in einem definierten In-vitro-Produktionssystem:
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1997
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1.
EINLEITUNG
.
1
2
SCHRIFTTUM
.
3
2.1
OOZYTEN
UND
FOLLIKEL
UND
EMBRYONALENTWICKLUNG
BEIM
RIND
.
3
2.2.
IN-VITRO-PRODUKTION
VON
RINDEREMBRYONEN
.
6
2
2.1.
OOZYTENGEWINNUNG
UND
SELEKTION
.
6
2.2.2.
IN-VITRO-REIFUNG
.
9
2
2.3.
IN-VITRO-FERTILISIERUNG
.
12
2.2.3.1.
AUFBEREITUNG
UND
IN-VITRO-KAPAZITIERUNG
DER
SPERMIEN
.
12
2
2.3.2.
KOINKUBATION
VON
EIZELLEN
UND
SPERMIEN
.
13
2.2.3.3.
BULLENEINFLUSS
.
14
2.2.4.
IN-VITRO-KULTIVIERUNG
VON
ZYGOTEN
.
16
2.2
5.
MEDIEN
.
16
2
2
6.
ZUSAETZE
.
18
2.2.6
1.
KOKULTUR
MIT
SOMATISCHEN
ZELLEN
.
18
2
2.6
2.
PROTEINE
.
29
2
2.6
3.
HORMONE
.
32
2.2.6.4.
WEITERE
ZUSAETZE
.
34
2.2.7.
DEFINIERTES
KULTIVIERUNGSSYSTEM
.
39
2.2.8.
PHYSIKOCHEMISCHE
KULTIVIERUNGSBEDINGUNGEN.
40
2
2.9
WACHSTUMSFAKTOREN
.
43
2.2.9
1.
KURZE
CHARAKTERISIERUNG
VON
WACHSTUMSFAKTOREN
.
43
2
2.9.2
WACHSTUMSFAKTOR
PDGF
IN
DER
PRAEIMPLANTATIVEN
.
EMBRYONALENTWICKLUNG
.
45
2
2.10
QUALITAETSBEURTEILUNG
VON
EMBRYONEN
.
48
2
2.11
DARSTELLUNG
VON
EMBRYONALEN
ZELLEN
DURCH
SPEZIFISCHE
FAERBUNGEN
.
49
3
MATERIAL
UND
METHODEN
.
51
3
1
MEDIEN
UND
ZUSAETZE
.
51
3.1
1.
MEDIENPRAEPARATION'
.
51
3
11.1.
MPBS
.
51
3.112
TCM
199+PVA
IN
AIR
.
51
3.11.3.
KULTURMEDIEN
(TCM
199+PVA/BSA)
.
51
3.1.1.4.
FERTILISIERUNGSMEDIEN
(SPERM-TALP,
FERT-TALP)
.
52
3.1.2.
ZUSAETZE
.
54
3.1.2.1.
HORMONE
.
54
3.1.2.2.
ZUSATZSTOFFE
FUER
DIE
SPERMIENKAPAZITATION
.
54
3.1.2.3.
WACHSTUMSFAKTOR
(PDGF)
.
55
3.1.2.4.
ANTIKOERPER
(ANTI-PDGF)
.
55
3.1.2.5.
KONTROLL-PUFFERLOESUNG
ZUR
VERDUENNUNG
VON
PDGF
UND
ANTI-PDGF
.
55
3.2.
FIXATIONEN
UND
FAERBUNGEN
.
56
3.2.1.
ACETO-ORCEIN-FAERBUNG
.
56
3.2.2.
FIXIERUNG
NACH
TARKOWSKI
UND
FAERBUNG
NACH
GIEMSA
.
56
3.2.3.
ERMITTLUNG
VON
ICM
UND
TROPHEKTODERMZELLEN
MITTELS
DOUBLE-DYE-TECHNIK
.
57
3.3.
OVARIENGEWINNUNG.
58
3.4.
OOZYTENISOLIERUNG
.
58
3.5.
OOZYTENKLASSIFIZIERUNG
.
59
3.6.
IN
VITRO
REIFUNG
.
60
3.7.
IN
VITRO
FERTILISIERUNG
.
61
3
8.
IN-VITRO-KULTIVIERUNG.
63
3.9.
MORPHOLOGISCHE
BEURTEILUNG
UND
ENTWICKLUNGSRATEN
.
63
3.10.
VERSUCHSAUFBAU
.
66
3.10.1.
IN-VITRO-PRODUKTION
VON
RINDEREMBRYONEN
IN
MEDIEN
MIT
ZUSATZ
VON
BSA
ODER
PVA
(EXPERIMENT
1)
.
66
3.10.1.1.
REIFUNGS-UND
FERTILISIERUNGSKONTROLLE
.
66
3.10.1.2.
ENTWICKLUNGSFAEHIGKEIT
DER
EMBRYONEN
UND
CHROMOSOMENANALYSE
.
66
3.10.2.
IN-VITRO-PRODUKTION
VON
RINDEREMBRYONEN
IN
MEDIEN
MIT
ZUSATZ
VON
BSA
ODER
PVA
UND
EINER
SPERMIENKONZENTRATION
VON
1X
10
6
/ML
ODER
5X
10
5
/ML
BEI
DER
IVF
(EXPERIMENT
2)
.
67
3.10.3.
IN-VITRO-PRODUKTION
VON
RINDEREMBRYONEN
IN
MEDIEN
MIT
ZUSATZ
VON
BSA
ODER
PVA
UND
VERWENDUNG
VON
SPERMIEN
ZWEIER
.
UNTERSCHIEDLICHER
BULLEN
(EXPERIMENT
3)
.
68
3.10.3.1.
UNTERSUCHUNG
DES
ZEITLICHEN
VERLAUFES
DER
BEFRUCHTUNG
.
(EXPERIMENT
3A)
.
68
3.10.3.2.
ENTWICKLUNGSFAEHIGKEIT
DER
EMBRYONEN
(EXPERIMENT
3B)
.
68
3
10.4.
WIRKUNGEN
VON
PDGF
AUF
DIE
IN-VITRO-PRODUKTION
VON
.
RINDEREMBRYONEN
IN
MEDIUM
MIT
PVA-ZUSATZ
(EXPERIMENT
4)
.
69
3.104.1.
ZUSATZ
VON
PDGF
INS
FERTILISIERUNGSMEDIUM
(EXPERIMENT
4A)
.
69
3.10.4.2
ZUSATZ
VON
PDGF
INS
FERTILISIERUNGSMEDIUM
UND
INS
KULTURMEDIUM
AN
TAG
3
(EXPERIMENT
4B)
.
69
3:10.4.3.
ZUSATZ
VON
PDGF
INS
FERTILISIERUNGSMEDIUM
UND
VERWENDUNG
VON
SPERMIEN
ZWEIER
BULLEN
(EXPERIMENT
4C)
.
69
3
11.
ALLGEMEINER
UND
SPEZIELLER
VERSUCHSAUFBAU
.
71
3.12.
STATISTISCHE
AUSWERTUNGEN
.
73
4.
ERGEBNISSE
.
74
4.1.
IN-VITRO-PRODUKTION
VON
RINDEREMBRYONEN
IN
MEDIEN
MIT
ZUSATZ
VON
BSA
ODER
PVA
(EXPERIMENT
1)
.
74
4.1.1.
REIFUNGS
UND
FERTILISIERUNGSKONTROLLE
.
74
4
1.2
ENTWICKLUNGSFAEHIGKEIT
DER
EMBRYONEN
UND
CHROMOSOMENANALYSE.
.
76
4.2.
IN-VITRO-PRODUKTION
VON
RINDEREMBRYONEN
IN
MEDIEN
MIT
ZUSATZ
VON
BSA
ODER
PVA
UND
EINER
SPERMIENKONZENTRATION
VON
1X
10
6
/ML
ODER
5X
10
5
/ML
BEI
DER
IVF
(EXPERIMENT
2)
.
77
4.3.
IN-VITRO-PRODUKTION
VON
RINDEREMBRYONEN
IN
MEDIEN
MIT
ZUSATZ
VON
BSA
ODER
PVA
UND
VERWENDUNG
VON
SPERMIEN
ZWEIER
.
UNTERSCHIEDLICHER
BULLEN
(EXPERIMENT
3)
.
80
4.3.1.
UNTERSUCHUNG
DES
ZEITLICHEN
VERLAUFES
DER
BEFRUCHTUNG
(EXPERIMENT
3A)
.
80
4.3
2.
ENTWICKLUNGSFAEHIGKEIT
DER
EMBRYONEN
(EXPERIMENT
3B)
.
84
4
3.3.
ERMITTLUNG
DER
ZELLZAHLEN
UND
DES
VERHAELTNISSES
ICM
/
GESAMTZELLZAHL
VON
IN
VITRO
PRODUZIERTEN
BLASTOZYSTEN
AN
KULTURTAG
8
(EXPERIMENT
3B)
.
85
4.4.
WIRKUNGEN
VON
PDGF
AUF
DIE
IN-VITRO-PRODUKTION
VON
RINDEREMBRYONEN
IN
MEDIUM
MIT
PVA-ZUSATZ
(EXPERIMENT
4)
.
.
87
4.4.1.
ZUSATZ
VON
PDGF
INS
FERTILISIERUNGSMEDIUM
(EXPERIMENT
4A)
.
87
4
4.1.1.
ENTWICKLUNGSFAEHIGKEIT
DER
EMBRYONEN
.
87
4.4.1.2.
ERMITTLUNG
DER
ZELLZAHLEN
IN
VITRO
PRODUZIERTER
BLASTOZYSTEN
AN
KULTURTAG
8
.
88
4.4.2.
ZUSATZ
VON
PDGF
INS
FERTILISIERUNGSMEDIUM
UND
INS
KULTURMEDIUM
AN
TAG
3
(EXPERIMENT
4B)
.
90
4.4.2.1.
ENTWICKLUNGSFAEHIGKEIT
DER
EMBRYONEN
.
90
4.4.2.2.
ERMITTLUNG
DER
ZEITZAHLEN
IN
VITRO
PRODUZIERTER
BLASTOZYSTEN
AN
KULTURTAG
8
.
91
4.4.3.
ZUSATZ
VON
PDGF
INS
FERTILISIERUNGSMEDIUM
UND
VERWENDUNG
VON
SPERMIEN
ZWEIER
BULLEN
(EXPERIMENT
4C)
.
93
4.4.3.1.
ENTWICKLUNGSFAEHIGKEIT
DER EMBRYONEN
.
93
4.4.3.2.
ERMITTLUNG
DER
ZEITZAHLEN
IN
VITRO
PRODUZIERTER
BLASTOZYSTEN
AN
KULTURTAG
8
.
95
5.
DISKUSSION
.
98
5.1.
IN-VITRO-PRODUKTION
VON
RINDEREMBRYONEN
IN
MEDIEN
MIT
ZUSATZ
VON
BSA
ODER
PVA
.
99
5.2.
WIRKUNGEN
VON
PDGF
AUF
DIE
IN-VITRO-PRODUKTION
VON
RINDEREMBRYONEN
IN
MEDIEN
MIT
PVA-ZUSATZ
.
103
5.3.
SCHLUSSFOLGERUNGEN
.
106
6.
ZUSAMMENFASSUNG.
108
7.
SUMMARY
.
111
8.
LITERATURVERZEICHNIS
.
115
9.
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS.
147
10.
TABELLENANHANG
.
149 |
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