Immunmodulation durch Fettsäuren: Bedeutung des zellulären Fettsäurenmusters für die Funktion einer caninen Mastozytomzelllinie
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Berlin
MBV, Mensch-und-Buch-Verl.
2008
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1 Einführung 1
2 Literaturübersicht 3
2.1 Grundlagen des Fettsäurenstoffwechsels 3
2.1.1 Fettsäuren 3
2.1.2 Mehrfach ungesättigte Fettsäuren und essentielle Fettsäuren 4
2.1.3 Elongation und Desaturierung 5
2.1.4 Mehrfach ungesättigte Fettsäuren und zelluläre Membranen 7
2.1.5 Mehrfach ungesättigte Fettsäuren und Eicosanoide 8
2.1.6 Mehrfach ungesättigte Fettsäuren und zytosolische Phospholipase A2 12
2.1.7 Mehrfach ungesättigte Fettsäuren und Phospholipase D 14
2.1.8 Mehrfach ungesättigte Fettsäuren und Peroxisom Proliferator-aktivierte
Rezeptoren 17
2.2 Canine Atopische Dermatitis (CAD) 19
2.2.1 Definitionen 19
2.2.2 Prävalenz 20
2.2.3 Ätiologie 21
2.2.4 Pathogenese 24
2.2.5 Klinisches Bild 27
2.2.6 Diagnose 28
2.2.7 Therapie 29
2.2.7.1 Allergeneliminierung 30
2.2.7.2 Pharraakotherapie 30
2.2.7.3 Spezifische Immunotherapie 32
2.2.7.4 Diätetik 33
23 Mastzellbiologie 34
2.4 Kurze Zusammenfassung der Literaturübersicht 40
3 Eigene Untersuchungen 42
3.1 Material 42
3.2 Methoden 42
3.2.1 Die Zelllinien C2 und COS-1 42
3.2.1.1 Zellkulturbedingungen der C2 43
3.2.1.2 Fettsäurensupplementierung des Dauerkulturmediums der C2 43
3.2.1.3 Zellkulturbedingungen der COS-1 44
3.2.1.4 Fettsäurensupplementierung des Dauerkulturmediums der COS-1 45
3.2.1.5 Gefrierkonservierung der C2 und COS-1 45
3.2.1.6 Vitalitätstest der Zellen mittels Trypanblau 45
3.2.1.7 Wachstumsverlauf der C2 46
3.2.1.8 Mykoplasmennachweis 46
3.2.2 Fettsäurenbestimmung 46
3.2.2.1 Zellpräparation 47
3.2.2.2 Probenvorbereitung 47
3.2.2.3 Gaschromatographie 47
3.2.3 Bestimmung der Histaminfreisetzung von C2 49
3.2.3.1 Zellpräparation 50
3.2.3.2 Probenvorbereitung 50
3.2.3.3 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie 51
3.2.4 Bestimmung der Aktivitäten der Mastzellproteasen Chymase und Tryptase 52
3.2.4.1 Chymase 52
3.2.4.2 Tryptase 52
3.2.5 Bestimmung der Prostaglandin E2-Freisetzung von C2 __ 53
3.2.5.1 Zellpräparation .53
3.2.5.2 Prostaglandin E2-Radio-Immuno-Assay 53
3.2.6 Bestimmung der Aktivität der zytosolischen Phospholipase A2a in C2 53
3.2.7 Messung des Gehaltes der zytosolischen Phospholipase A2 und des Peroxisomen
Proliferator-aktivierten Rezeptors y in C2 mittels Western Blot 54
3.2.7.1 Zellpräparation _54
3.2.7.2 Proteinbestimmung 55
3.2.7.3 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese(SDS-PAGE) __55
3.2.7.4 Western Blot 56
3.2.7.5 Nachweis der zytosolischen Phospholipase A2 und des Peroxisomen
Proliferator Aktivierenden Rezeptors y mit Antikörpern 57
3.2.8 Bestimmung der Aktivität der Phospholipase D in Cos-1 58
3.2.8.1 Zellpräparation 58
3.2.8.2 Lipidextraktion 59
3.2.8.3 Dünnschichtchromatographie 59
3.2.9 Transfektion der COS-1 zur Untersuchung der intrazellulären Lokalisation der
Phospholipasen Dl und 2. 59
3.2.9.1 Transformation von Escherichia coli HB101 60
3.2.9.2 Plasmidisolation 60
3.2.9.3 Transfektion der COS-1 mittels Diethylaminoethyl-Dextran 63
3.2.9.4 Konfokale Lasermikroskopie 63
3.2.10 Statistische Verfahren 64
4 Ergebnisse 66
4.1 Histologische Dokumentation der Zelllinie C2 66
4.2 Einfluss der Fettsäurensupplementierungen des Kulturmediums auf das
Wachstum der C2. 67
4.2.1 Grundmedium DEH 67
4.2.2 Linolsäure 68
4.2.3 Y-Lino ensäure 69
4.2.4 Arachidonsäure 70
4.2.5 a-Iinolensäure 71
4.2.6 Eicosapentaensäure 72
4.2.7 Docosahexaensäure 73
4.3 Einfluss der Fettsäurensupplementierungen des Kulturmediums auf das Fett¬
säurenmuster der C2 74
4.3.1 Linolsäure 74
4.3.2 Y Linolensäure 75
4.3.3 Arachidonsäure 76
4.3.4 a-linolensäure 76
4.3.5 Eicosapentaensäure 78
4.3.6 Docosahexaensäure 78
4.4 Histaminfreisetzung der C2 80
4.4.1 Unstimulierte Histaminfreisetzung 80
4.4.2 Stimulierte Histaminfreisetzung 81
4.5 Aktivitäten der Proteasen Chymase und Tryptase 83
4.5.1 Chymase 83
4.5.2 Tryptase 84
4.6 Prostaglandin E2 85
4.6.1 Unstimulierte Prostaglandin E2-Freisetzung 85
4.6.2 Stimulierte Prostaglandin E2-Freisetzung 86
4.7 Aktivität der zytosolischen Phospholipase A2 87
4.7.1 Unstimulierte Aktivität der zytosolischen Phospholipase A2 87
4.7.2 Stimulierte Aktivität der zytosolischen Phospholipase A2 88
4.8 Expression der zytosolischen Phospholipase A2 89
4.9 Expression des Peroxisom Proliferatior-aktivierten Rezeptors y in C2 90
4.10 Aktivität der Phospholipase D in COS-1 91
4.11 Konfokale Lasermikroskopie von transient transfizierten COS-1 92
5 Diskussion 94
5.1 Histologische Dokumentation der C2 96
5.2 Wachstum der C2 97
5.2.1 Fötales Kälberserum 97
5.2.2 Fettsäurensupplementierungen und Wachstum 98
53 Fettsäurenmuster der C2 101
5.3.1 Einbau der supplementierten Fettsäuren in C2 101
5.3.2 Synthese langkettiger mehrfach ungesättigter Fettsäuren in den C2 aus C18-
Fettsäuren 104
5.3.3 Synthese langkettiger mehrfach ungesättigter Fettsäuren in den C2 aus C20- und
C22-Fettsäuren 106
5.4 Auswirkungen des veränderten Fettsäurenmusters der C2 auf die
Histaminfreisetzung 108
5.5 Auswirkungen des veränderten Fettsäurenmusters der C2 auf die Aktivität der
Mastzellproteasen Chymase und Tryptase 113
5.6 Auswirkungen des veränderten Fettsäurenmusters der C2 auf die Prostaglandin
E2-Produktion 115
5.7 Auswirkungen des veränderten Fettsäurenmusters der C2 auf die Aktivität der
zytosolischen Phospholipase A2 a. 118
5.8 Auswirkungen des veränderten Fettsäurenmusters der C2 auf die Expression der
zytosolischen Phospholipase A2 ex. 121
5.9 Auswirkungen des veränderten Fettsäurenmusters der C2 auf die Expression des
Peroxisom Proliferator-aktivierten Rezeptors y. 125
5.10 Auswirkungen der Supplementierung des Kulturmediums von COS-1 mit a-
Linolen- oder Linolsäure auf die Aktivität der Phospholipase D. 129
5.11 Intrazelluläre Lokalisation der Phospholipase Dl und D2 in COS-1 133
6 Zusammenfassung 135
7 Summary 138
8 Literaturverzeichnis 141
9 Anhang 191
9.1 Tabellen 191
9.2 Danksagung 195
|
| adam_txt |
Inhaltsverzeichnis
1 Einführung 1
2 Literaturübersicht 3
2.1 Grundlagen des Fettsäurenstoffwechsels 3
2.1.1 Fettsäuren 3
2.1.2 Mehrfach ungesättigte Fettsäuren und essentielle Fettsäuren 4
2.1.3 Elongation und Desaturierung 5
2.1.4 Mehrfach ungesättigte Fettsäuren und zelluläre Membranen 7
2.1.5 Mehrfach ungesättigte Fettsäuren und Eicosanoide 8
2.1.6 Mehrfach ungesättigte Fettsäuren und zytosolische Phospholipase A2 12
2.1.7 Mehrfach ungesättigte Fettsäuren und Phospholipase D 14
2.1.8 Mehrfach ungesättigte Fettsäuren und Peroxisom Proliferator-aktivierte
Rezeptoren 17
2.2 Canine Atopische Dermatitis (CAD) 19
2.2.1 Definitionen 19
2.2.2 Prävalenz 20
2.2.3 Ätiologie 21
2.2.4 Pathogenese 24
2.2.5 Klinisches Bild 27
2.2.6 Diagnose 28
2.2.7 Therapie 29
2.2.7.1 Allergeneliminierung 30
2.2.7.2 Pharraakotherapie 30
2.2.7.3 Spezifische Immunotherapie 32
2.2.7.4 Diätetik 33
23 Mastzellbiologie 34
2.4 Kurze Zusammenfassung der Literaturübersicht 40
3 Eigene Untersuchungen 42
3.1 Material 42
3.2 Methoden 42
3.2.1 Die Zelllinien C2 und COS-1 42
3.2.1.1 Zellkulturbedingungen der C2 43
3.2.1.2 Fettsäurensupplementierung des Dauerkulturmediums der C2 43
3.2.1.3 Zellkulturbedingungen der COS-1 44
3.2.1.4 Fettsäurensupplementierung des Dauerkulturmediums der COS-1 45
3.2.1.5 Gefrierkonservierung der C2 und COS-1 45
3.2.1.6 Vitalitätstest der Zellen mittels Trypanblau 45
3.2.1.7 Wachstumsverlauf der C2 46
3.2.1.8 Mykoplasmennachweis 46
3.2.2 Fettsäurenbestimmung 46
3.2.2.1 Zellpräparation 47
3.2.2.2 Probenvorbereitung 47
3.2.2.3 Gaschromatographie 47
3.2.3 Bestimmung der Histaminfreisetzung von C2 49
3.2.3.1 Zellpräparation 50
3.2.3.2 Probenvorbereitung 50
3.2.3.3 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie 51
3.2.4 Bestimmung der Aktivitäten der Mastzellproteasen Chymase und Tryptase 52
3.2.4.1 Chymase 52
3.2.4.2 Tryptase 52
3.2.5 Bestimmung der Prostaglandin E2-Freisetzung von C2 _ 53
3.2.5.1 Zellpräparation .53
3.2.5.2 Prostaglandin E2-Radio-Immuno-Assay 53
3.2.6 Bestimmung der Aktivität der zytosolischen Phospholipase A2a in C2 53
3.2.7 Messung des Gehaltes der zytosolischen Phospholipase A2 und des Peroxisomen
Proliferator-aktivierten Rezeptors y in C2 mittels Western Blot 54
3.2.7.1 Zellpräparation _54
3.2.7.2 Proteinbestimmung 55
3.2.7.3 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese(SDS-PAGE) _55
3.2.7.4 Western Blot 56
3.2.7.5 Nachweis der zytosolischen Phospholipase A2 und des Peroxisomen
Proliferator Aktivierenden Rezeptors y mit Antikörpern 57
3.2.8 Bestimmung der Aktivität der Phospholipase D in Cos-1 58
3.2.8.1 Zellpräparation 58
3.2.8.2 Lipidextraktion 59
3.2.8.3 Dünnschichtchromatographie 59
3.2.9 Transfektion der COS-1 zur Untersuchung der intrazellulären Lokalisation der
Phospholipasen Dl und 2. 59
3.2.9.1 Transformation von Escherichia coli HB101 60
3.2.9.2 Plasmidisolation 60
3.2.9.3 Transfektion der COS-1 mittels Diethylaminoethyl-Dextran 63
3.2.9.4 Konfokale Lasermikroskopie 63
3.2.10 Statistische Verfahren 64
4 Ergebnisse 66
4.1 Histologische Dokumentation der Zelllinie C2 66
4.2 Einfluss der Fettsäurensupplementierungen des Kulturmediums auf das
Wachstum der C2. 67
4.2.1 Grundmedium DEH 67
4.2.2 Linolsäure 68
4.2.3 Y-Lino'ensäure 69
4.2.4 Arachidonsäure 70
4.2.5 a-Iinolensäure 71
4.2.6 Eicosapentaensäure 72
4.2.7 Docosahexaensäure 73
4.3 Einfluss der Fettsäurensupplementierungen des Kulturmediums auf das Fett¬
säurenmuster der C2 74
4.3.1 Linolsäure 74
4.3.2 Y'Linolensäure 75
4.3.3 Arachidonsäure 76
4.3.4 a-linolensäure 76
4.3.5 Eicosapentaensäure 78
4.3.6 Docosahexaensäure 78
4.4 Histaminfreisetzung der C2 80
4.4.1 Unstimulierte Histaminfreisetzung 80
4.4.2 Stimulierte Histaminfreisetzung 81
4.5 Aktivitäten der Proteasen Chymase und Tryptase 83
4.5.1 Chymase 83
4.5.2 Tryptase 84
4.6 Prostaglandin E2 85
4.6.1 Unstimulierte Prostaglandin E2-Freisetzung 85
4.6.2 Stimulierte Prostaglandin E2-Freisetzung 86
4.7 Aktivität der zytosolischen Phospholipase A2 87
4.7.1 Unstimulierte Aktivität der zytosolischen Phospholipase A2 87
4.7.2 Stimulierte Aktivität der zytosolischen Phospholipase A2 88
4.8 Expression der zytosolischen Phospholipase A2 89
4.9 Expression des Peroxisom Proliferatior-aktivierten Rezeptors y in C2 90
4.10 Aktivität der Phospholipase D in COS-1 91
4.11 Konfokale Lasermikroskopie von transient transfizierten COS-1 92
5 Diskussion 94
5.1 Histologische Dokumentation der C2 96
5.2 Wachstum der C2 97
5.2.1 Fötales Kälberserum 97
5.2.2 Fettsäurensupplementierungen und Wachstum 98
53 Fettsäurenmuster der C2 101
5.3.1 Einbau der supplementierten Fettsäuren in C2 101
5.3.2 Synthese langkettiger mehrfach ungesättigter Fettsäuren in den C2 aus C18-
Fettsäuren 104
5.3.3 Synthese langkettiger mehrfach ungesättigter Fettsäuren in den C2 aus C20- und
C22-Fettsäuren 106
5.4 Auswirkungen des veränderten Fettsäurenmusters der C2 auf die
Histaminfreisetzung 108
5.5 Auswirkungen des veränderten Fettsäurenmusters der C2 auf die Aktivität der
Mastzellproteasen Chymase und Tryptase 113
5.6 Auswirkungen des veränderten Fettsäurenmusters der C2 auf die Prostaglandin
E2-Produktion 115
5.7 Auswirkungen des veränderten Fettsäurenmusters der C2 auf die Aktivität der
zytosolischen Phospholipase A2 a. 118
5.8 Auswirkungen des veränderten Fettsäurenmusters der C2 auf die Expression der
zytosolischen Phospholipase A2 ex. 121
5.9 Auswirkungen des veränderten Fettsäurenmusters der C2 auf die Expression des
Peroxisom Proliferator-aktivierten Rezeptors y. 125
5.10 Auswirkungen der Supplementierung des Kulturmediums von COS-1 mit a-
Linolen- oder Linolsäure auf die Aktivität der Phospholipase D. 129
5.11 Intrazelluläre Lokalisation der Phospholipase Dl und D2 in COS-1 133
6 Zusammenfassung 135
7 Summary 138
8 Literaturverzeichnis 141
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