Entschlüsselung von Aktivierungsmechanismen des Epstein-Barr-Virus mittels reverser Genetik:
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2007
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 4
1.1. Das Epstein-Barr Virus 4
1.2. Virale Persistenz und Reaktivierung 4
1.3. Reverse EBV-Genetik 6
1.4. Aufgabenstellung 7
2. Material und Methoden 9
2.1. Material 9
2.1.1. Zellinien 9
2.1.2. Bakterienstämme 9
2.1.3. Plasmide 9
2.1.4. Primer und Hybridisierungssonden 10
2.1.5. Zellkulturmedien 11
2.1.6. Puffer-Lösungen 12
2.2. Methoden 13
2.2.1. Standardmethoden der Molekularbiologie 13
2.2.2. Partielle Restriktion genomischer EBV-DNA 13
2.2.3. Dichtegradientenzentrifiigation 13
2.2.4. Ligation mit Cosmid-Vektoren 14
2.2.5. Kultivierung von Mammalia-Zellen 14
2.2.6. Isolierung von B-Lymphozyten aus Vollblut 15
2.2.7. Transfektion von eukaryotischen Zellen durch Endozytose 15
2.2.8. Superinfektion von Raji-Zellen 17
2.2.9. Virusinfektion EBV-negativer Zellen 18
2.2.10. Präparation von Nukleinsäuren aus Bakterien, Zellkulturen und
Zellkulturüberständen 19
2.2.11. Reverse Transkription 19
2.2.12. PCR (Pofymerasekettenreaktion) 19
2.2.13. In-vitro-Transposonmutagenese 24
2.2.14. Southern Blot 25
2.2.15. Immunfluoreszenztest (IFT) 26
2.2.16. Durchfliißzytometrie 26
2.2.17. Proteinisolierung aus Mammalia-Zellen 27
2.2.18. Western Blot 27
2.2.19. Inhibition der Aktivität von PLA2, PKC und PB-Kinase 28
3. Ergebnisse 29
3.1. Untersuchungen zum Einfluß EBV-kodierter Gene auf den lyrischen Zyklus 29
3.1.1. Konstruktion einer genomischen EBV-Bank 30
3.1.2. Konstruktion eines Tn-5 basierenden transposablen Elementes 31
3.1.3. Generieren einer Mutantenbank 31
3.1.4. Rekombination und Selektion von EBV-Mutanten 33
3.1.5. Charakterisierung des Phänotyps von EBV-BGLF5mima 35
3.1.6. Aufnahme einer BGLFS-Expressionskinetik in Wildtyp-EBV infizierten B-
Lymphozyten 42
3.2. Bedeutung von 14-3-3 £/PLA2 und s-Adenosylhomocystein Hydrolase für die
Initiation des lyrischen EBV-Zyklus 44
3.2.1. Lytische Reaktivierung des Epstein-Barr Virus durch 14-3-3 PLA2 45
2
3.2.2. Abhängigkeit der SAH-getriggerten lyrischen Reaktivierung von der 14-3-3
QPLA2 Expression 46
3.2.3. Einfluß von Proteinkinase C auf die SAH-getriggerte und 14-3-3 gPLA2-
getriggerte Initiierung des viralen lyrischen Zyklus 48
3.2.4. Modulation der Aktivität der BZLF1-Promotoren durch SAH- oder 14-3-3 £PLA2-
Überexpression 49
3.3. Bedeutung von Proteinkinase B (PKB) für die Initiation des lyrischen EBV-Zyklus.. 50
3.3.1. Lyrische Reaktivierung des Epstein-Barr Virus durch PKB 51
3.3.2. Abhängigkeit der PKB-getriggerten Initiierung des viralen lyrischen Zyklus von
Proteinkinase C 52
3.3.3. Modulation der Aktivität von BZLF1-Promotoren durch PKB-Überexpression.. 53
3.3.4. Bedeutung von PKBfiir die spontane Aktivierung des lyrischen EBV-Zyklus 54
4. Diskussion 57
4.1. Etablierung einer neuen Methode der reversen EBV-Genetik 57
4.2. Bedeutung der viralen DNase (BGLF5) für die EBV-Reaktivierung 59
4.3. Zusammenwirken von SAH und 14-3-3 £/PLA2 bei der Reaktivierung des lytischen
EBV-Zyklus 65
4.4. Einfluß der Proteinkinase B auf die lytische EBV-Reaktivierung 69
4.5. Ausblick 72
5. Zusammenfassung 73
6. Literaturverzeichnis 75
7. Abkürzungsverzeichnis 84
3
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Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 4
1.1. Das Epstein-Barr Virus 4
1.2. Virale Persistenz und Reaktivierung 4
1.3. Reverse EBV-Genetik 6
1.4. Aufgabenstellung 7
2. Material und Methoden 9
2.1. Material 9
2.1.1. Zellinien 9
2.1.2. Bakterienstämme 9
2.1.3. Plasmide 9
2.1.4. Primer und Hybridisierungssonden 10
2.1.5. Zellkulturmedien 11
2.1.6. Puffer-Lösungen 12
2.2. Methoden 13
2.2.1. Standardmethoden der Molekularbiologie 13
2.2.2. Partielle Restriktion genomischer EBV-DNA 13
2.2.3. Dichtegradientenzentrifiigation 13
2.2.4. Ligation mit Cosmid-Vektoren 14
2.2.5. Kultivierung von Mammalia-Zellen 14
2.2.6. Isolierung von B-Lymphozyten aus Vollblut 15
2.2.7. Transfektion von eukaryotischen Zellen durch Endozytose 15
2.2.8. Superinfektion von Raji-Zellen 17
2.2.9. Virusinfektion EBV-negativer Zellen 18
2.2.10. Präparation von Nukleinsäuren aus Bakterien, Zellkulturen und
Zellkulturüberständen 19
2.2.11. Reverse Transkription 19
2.2.12. PCR (Pofymerasekettenreaktion) 19
2.2.13. In-vitro-Transposonmutagenese 24
2.2.14. Southern Blot 25
2.2.15. Immunfluoreszenztest (IFT) 26
2.2.16. Durchfliißzytometrie 26
2.2.17. Proteinisolierung aus Mammalia-Zellen 27
2.2.18. Western Blot 27
2.2.19. Inhibition der Aktivität von PLA2, PKC und PB-Kinase 28
3. Ergebnisse 29
3.1. Untersuchungen zum Einfluß EBV-kodierter Gene auf den lyrischen Zyklus 29
3.1.1. Konstruktion einer genomischen EBV-Bank 30
3.1.2. Konstruktion eines Tn-5 basierenden transposablen Elementes 31
3.1.3. Generieren einer Mutantenbank 31
3.1.4. Rekombination und Selektion von EBV-Mutanten 33
3.1.5. Charakterisierung des Phänotyps von EBV-BGLF5mima 35
3.1.6. Aufnahme einer BGLFS-Expressionskinetik in Wildtyp-EBV infizierten B-
Lymphozyten 42
3.2. Bedeutung von 14-3-3 £/PLA2 und s-Adenosylhomocystein Hydrolase für die
Initiation des lyrischen EBV-Zyklus 44
3.2.1. Lytische Reaktivierung des Epstein-Barr Virus durch 14-3-3 PLA2 45
2
3.2.2. Abhängigkeit der SAH-getriggerten lyrischen Reaktivierung von der 14-3-3
QPLA2 Expression 46
3.2.3. Einfluß von Proteinkinase C auf die SAH-getriggerte und 14-3-3 gPLA2-
getriggerte Initiierung des viralen lyrischen Zyklus 48
3.2.4. Modulation der Aktivität der BZLF1-Promotoren durch SAH- oder 14-3-3 £PLA2-
Überexpression 49
3.3. Bedeutung von Proteinkinase B (PKB) für die Initiation des lyrischen EBV-Zyklus. 50
3.3.1. Lyrische Reaktivierung des Epstein-Barr Virus durch PKB 51
3.3.2. Abhängigkeit der PKB-getriggerten Initiierung des viralen lyrischen Zyklus von
Proteinkinase C 52
3.3.3. Modulation der Aktivität von BZLF1-Promotoren durch PKB-Überexpression. 53
3.3.4. Bedeutung von PKBfiir die spontane Aktivierung des lyrischen EBV-Zyklus 54
4. Diskussion 57
4.1. Etablierung einer neuen Methode der reversen EBV-Genetik 57
4.2. Bedeutung der viralen DNase (BGLF5) für die EBV-Reaktivierung 59
4.3. Zusammenwirken von SAH und 14-3-3 £/PLA2 bei der Reaktivierung des lytischen
EBV-Zyklus 65
4.4. Einfluß der Proteinkinase B auf die lytische EBV-Reaktivierung 69
4.5. Ausblick 72
5. Zusammenfassung 73
6. Literaturverzeichnis 75
7. Abkürzungsverzeichnis 84
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