Die hypertone Bewegungsstörung der Mausmutante Spastic: der Einfluß genetischer Heterogenität auf den Spleißpathomechanismus der ß-Untereinheit des inhibitorischen Glycin-Rezeptors und die damit assoziierte Variabilität des Phänotyps
Gespeichert in:
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|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2008
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | IX, 206, XXI S. Ill., graph. Darst. |
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| adam_text | Titel: Die hypertone Bewegungsstörung der Mausmutante Spastic
Autor: Braune, Marlen
Jahr: 2008
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
ZUSAMMENFASSUNG 1
SUMMARY 2
einleitung 5
1. hyperekplexie 5
2. Struktur und Funktionsweise des Nervensystem 7
2.1 Gliederung des Nervensystems 7
2.2 entwicklung des nervensystems 8
2.3 Neuronale Plastizität 9
2.4 Bausteine des Nervensystems 9
2.5 DlESYNAPSE 12
2.6 Membrankanäle 14
2.7 neurotransmitter 16
3. Der inhibitorische Glycin-Rezeptor 17
3.1 Allgemeines 17
3.2 Struktur und Funktionsweise 17
3.3 LlGANDENBINDUNG 21
4. Von der DNA zum Protein 23
4.1 DlEDNA 23
4.2 DlEDNA ALSM41WZE 24
4.3 MRNA-PROZESSIERUNG 25
4.3.7 Spleißen 27
4.3.2 DasSpleißosom 27
4.3.3 Die Molekularbiologie des Spleißens 28
4.3.4 Chemische Vorgänge 29
4.3.5 SR-Proteine und hnRNPs 30
4.4 retroposonsimGenom 31
5. Das Mausmodell 34
j.7 glycin-rezeptor-defiziente mause 34
5.2 die spastische maus 35
6. Ziele der Arbeit 38
material und methoden 4j
7. Material 41
7.1 Bakterien 41
7.2 Chemikalien 42
7.2.1 Allgemeine Chemikalien 42
7.2.2 Spezielle Chemikalien 43
7.3 DNA-GROßENMARKER 44
7.4 Enzyme 44
7.5 GERATE 45
7.6 ougonuklbotide 47
7.7 Vektoren 47
7.« Verbrauchsmaterialien 47
7.9 Versuchstiere 48
7.70 zellkulturen 48
8. Molekularbiologische Methoden 49
Ä7 RNA-PRÄPARATION 49
i
Inhaltsverzeichnis
8.2 CDNA-SYNTHESE (REVERSETRANSKRIPTION) 50
8.3 POLYMEMASE-KETTEN-REAKTION (PCR) 51
8.4 ElIXTROPHORETISCHEDNA-AUFTRENNUNG 53
8.4.1 Agarose-Geie 53
8.4.2 Polyacrylamid-Gele 55
8.5 DNA-PRÄPARATION 56
8.5.1 Präparation von kleinen Mengen Plasmid-DNA (Mini-Präp) 56
8.5.2 Präparation von größeren Mengen Plasmid-DNA (Maxi-Präp) 57
8.5.3 Praparation von den DNA aus Agarose-Gelen und PCR-Ansätzen 58
8.5.4 Isolierung von Mausschwanz-DNA 58
8.6 DNA-MOD1F1ZIERENDE METHODEN 58
8.6.1 Restriktionsverdau 58
8.6.2 Dephosphorylierung 60
8.6.3 Ligation 60
8.7 TRANSFORMATION 61
8.8 SEQUENZIERUNG NACH SANGER 63
8.9 REAL-T1MEQUANTITATIVEPCR(RTQ-PCR} 64
8.10 MAWI-TOF-MS 68
9. Zellbiologische Methoden 72
9.1 anlegen vonmurinenastrozyten-kulturen 72
9.2 kultivierung vonädhäsjonszei£en 73
9.3 transfektionvonzeixen 74
9.3.1 Calcium-Phosphat-Transfektion 75
9.3.2 Liposomale Transfektion 76
9.4 NACHWEIS VON SMRV-KONTAMNATIONEN IN ZELLKULTUREN 77
9.4.1 Nachweis des Provirus 78
9.4.2 Nachweis replikativer Viren 79
10. proteinbiochemische Methoden 81
10.1 rna-puij.-downassay 81
10.2 COOMASSIE-BRILUANT-BLAU 85
10.3 WesternBlotting 86
ERGEBNISSE 82
11. Phänotypische Charakterisierung der Mausmutante spastic 89
//./ Zuchtund Genotypisierung 90
11.2 Klassifizierung dermurinenHyperekplexie 93
11.3 EINFLUß des genetischen Hintergrundes 96
11.4 HypertoneBewegungsstörung 98
11.5 Glrb-Transkripimengen 1o°
12. Heterogenitätsuntersuchungen 1°3
12.1 Mapping der Hot Spot-Region l°3
12.2 SNP-ANALYSEMITMALDl-TOF-kß 1°5
12.2.1 SNP-Analyse von Clk2 1°7
12.2.2 SNP-Analyse von Ptbp2 l09
12.2.3 SNP-AnalysevonMedl3l/Thrap2
12.2.4 SNP-Analyse von Duspl4 2
12.2.5 SNP-Analyse von SfrslS 3
13. G/J8B-SPLEIBPATBOMECHANISMIIS l*4
13.1 MINIGENKONSTRUKTION 6
13.2 EINFLUß DER LÄNGE VONLINE1 AUF DASGLRB-SPLEIßEN 7
13.3 FUNKTIONAJJTAT DER LINE1-ORFS 12°
13.4 LINEUNABHÄNGIGKEIT VOMMiNIGEN-HINTERGRUND I23
13.5 SEQUENZIERUNG UNDDATENBANKABGLE1CHDER GLRB-KONSTRUKTE 124
13.6 SNPSMGLRB-GEN 125
ii
Inhaltsverzeichnis
13.7 einfluß derglrb-snps auf die eses 126
14. Gläb-RNA-Interaktion mit Zellkernproteinen 128
14.1 rna-pull-down-assayvonglrbexon5 129
14.1.1 Interaktionsnachweis von GlrbExon 5 mit ASF/SF2 130
14.1.2 Bindeverhalten der SRp-Familie 130
14.1.3 Assoziation mit der Familie der hnRNPs 131
14.1.4 Bindeverhalten von TIAL1 132
14.2 KNA-PULL-EK mi-ASSAYVONExON6 133
14.2.1 ASF/SF2-Bindung an die G/rA Exon 6-RNA 134
14.2.2 Interaktion der SR-Proteine mit der Glrb Exon 6-RNA 135
14.2.3 Glrb Exon 6-RNA-Bindung an die hnRNPs 136
14.2.4 Exon 6-Interaktion mit TIAL1 137
14.2.5 C14orfl66-Interaktion mit der Glrb Exon 6-RNA 138
15. ASF/SF2 EIN POTENTIELLER GiÄB-SPLEIBMODULATOR 140
15.1 Mauslinien- und Gewebe-spezifische Transkription von ASF/SF2 141
15.2 ASF/SF2-ExPRESsioNin Gewebe 142
15.3 ASF/SF2lMINVIVOSPLEIßASSAY 143
15.4 Emetin-Assay: Nonsensemediated decayderGlrb-Transkripte 145
16. elnfluo kleiner moleküle auf das giäb-transkriptlonsmuster 149
16.1 wildtyptranskript erhöhende substanzen 152
16.1.1 Natrium-(ortho-) Vanadat 152
16.1.2 Natrium-Butyrat 154
16.1.3 Cycloheximid 156
16.1.4 Gentamicin 158
16.2 CHEMIKALIEN, DIE DAS KONSTITUTIVE GLRB-SPLElßEN SUPRMEREN 159
16.2.1 Aclacinomycin A 159
16.2.2 Trichostatin A 161
16.3 Zusammenfassungderwirkstoffanalyse 163
diskussion 165
17. Ausprägung des spastischen Phänotvps in Abhängigkeit vom genetischen
Hintergrund 166
17.1 die spastische zucht 166
17.2 Ausprägung der hyperTonen Bewegungsstörungen 167
17.3 DiephAnotypischeVariabiutätinZusammenhang mitdemGenotyp 167
17.4 die rolle derglycin-rezeptor ß-unterelnheit 170
18. ElNFLUiDESi//VE/-ELEMENTESAUFDENCtÄB™ -SPLEiaPATHOMECHANISMUS 172
18.1 DIE MINIGENKONSTRUKTION UND KWN1ERUNGSARTEFAKTE 172
18.2 EmFWßDERUNEl-STRUKTURELEMENTEAUFDASGLRB-SPLElßEN 173
18.3 Diebedeutung derunei-ORF s 174
19. Die Modulation des spastischen Phänotvps 175
19.1. die suche nach dem modulator auf dna-niveau 175
19.2. die veränderte protein-rna-1n1eraktion 175
19.3. Expressionsprofil der potentiellen Kandidaten 177
19.4. wirkung derputatwenmodulatoren imzellkulwr-modell 177
19.5. snp-analyse der kandidatengene 178
19.6. die rolle des ess in exon 6 von glrb 178
2a Dm Rolle von ASF/SF2 beim Gljw-Spleiien 181
20.1. Interaktion von ASF/SF2 mitderGlrb-RNA 181
20.2 EINFLUß IM IN VTVO-ZELLKULTUR-SYSTEM 182
20.3. Auswirkung vonPolymorphismenaufPhosphoryuerung und Aktivität vonASF/SF2 183
20.4. ASF/SF2-AUTOREGUUTION: TRANSKRIPTIONS- UNDEXPRESSIONaMSTER 184
21. Therapuansatz 186
22. Ausblick 188
ii
22.1. DIE SUCHE NACH DEM MODULATOR l88
212. RtSCVEDESSPASTtSCHENPHANOTYPS l89
22.3. ZUSÄTZLICHE PHANOTYPISCHE ANALYSEN 19°
224. OFFENE FRAGESTELLUNGEN 191
UTERATtntVFBTPirHTJlS 121
23. literatur 193
23.1 Referenzen 193
23.2 verwendete bücher 206
ANHANG I
24. Abkürzungen I
24.1. Verwendete Abkürzungen I
2*2. PHYSIKALISCHE GRÖßEN II
2*3. GRIESCH/SCHES ALPHABET III
2*-/. ivpac-cox in
2*5. AMSNOSAUKE-BEZBCHNUNGEN IV
25. GUW^EQUIHZEN V
2AA C57BU6JSBSUENZ V
25.2. C3H/HEJSEQUENZ Vjk
26. KONSTOUKIX Vfflf *
2 A MWXiENKOtiSnWKTE VIII
2 2. GenkartenDmvERWENDETENExPRESsioNsvExroREN X
26.3. GENKARTEN DERVERmNDETENBASlS-MlNIGENKONSTRUKTE XIII
27. OuGONinaEorrmsEQVENZEN XV
27./. MUTAGENESE-PRIMER XV
27.5. GENOTYP1SIERUNGS-PRIMER XVIII
27.6. „MAPPING -PRMER XVm
27.7. PRIMER FÜR DIE SNP-ANALYSE XIX
27.8. PRIMER FOR DEN SMRV-NACHWE1S XIX
28. Antikörper XX
DANKSAGUNG XH
iv
Abbildungver ichnis
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Nummer Seite
Abbildung 1: Aufbau des menschlichen ZNS 7
Abbildung 2: Die Stadien der Neurulation. 8
Abbildung 3: Motphologie verschiedener Neurontypen 9
Abbildung 4: Bau eines Neurons 10
Abbildung 5: Bau der Gliazellen 11
Abbildung 6: Funktion der Astrozyten 12
Abbildung 7: Vorgänge an der chemischen Synapse 13
Abbildung 8: Bau der elektrischen Synapse 14
Abbildung 9: Isoformen des murinen Glycin-Rezeptors 18
Abbildung 10: Domänenstruktur und Signalsequenzen der alpha-UE 18
Abbildung 11: Spleißvarianten der aj-Untereinheiten des Glycin-Rezeptors 20
Abbildung 12: Struktur der Agonisten und Afltagonisten des Glycin-Rezeptors 21
Abbildung 13: Funktionsweise der glycinergen Synapse 22
Abbildung 14: Verpackung der DNA in Chromosomen 23
Abbildung 15: Der Vorgang der Replikaoon 24
Abbildung 16: Ablauf der Transkription und Translation 25
Abbildung 17: mRNA-Prozessierungsvorgänge 26
Abbildung 18: Übersicht über die Konsensussequenzen 28
Abbildung 19: Die Komponenten des Spleißosoms und der Ablauf des Spleiß-Vorgangs 29
Abbildung 20: Lariat-Bildung und chemische Reaktionsabläufe während des Spleißens 30
Abbildung 21: Bau der verschiedenen Retroposon-Familien 33
Abbildung 22: Struktur des GA** -Gens und seine Spleißvarianten 36
Abbildung 23: Vergleich spastudxrVhmotmcn Ghifflf (links) mit gesunden Mäusen (rechts) beim Taü-Test
37
Abbildung 24: DNA-Größenmarker. 44
Abbildung 25: Aufbau eines LightCyclers und der verwendete Glaskapillaren 65
Abbildung 26: Graphische Darstellung der IightCycler-Absorpnonsmessijng 66
Abbildung 27: Prinzip des MALDI (Matrix-Assisted-Lascr-Desorption/Ionizanon) 68
Abbildung 28: Flugzcitamlyse^iMt-o/^fTOF) von RcmcJekülen 69
Abbildung 29: Massenspektrum einer MALDI-TOF-Massenspektrometrie 69
Abbildung 30: Arbeitsschema für den SMRV-Nachweis Queue: ZKBS 77
Abbildung 31: Ergebnis des proviralen SMRV-Nachweises 79
Abbildung 32: Nachweis repHkativer SMR-Viren 80
Abbadung 33: Versuchsaufbau der RNA-PuB-Down Analyse 81
Abbildung 34: Genotypisierung 91
v
,1
MbilimgmitiAms
Abbildung 35: Jahreszeitabhängige Zuchtcrfolge 9Z
Abbildung 36: Anzahl aller Phänotypen W
Abbadung 37: Gewichtsproö von Mäusen einer C57BL/6J GW f x C57BL/6J GH * -Verpaarung 94
Abbildung 38: Gewichtsverlauf und Größenunterschied der Tiere eines Wurfes *
Abbildung 39: Taü-Test .puO fer Phänotypen GM#4f (links) im Vergleich zu gesunden Mäusen (rechts) 95
Abbildung 40: Darstellung des .Jon i^rifhlmng eines spaslixbtn Phänotyps 95
Abbildung 41: Gewichtsprofil der ^uatatar Population in Abhängigkeit vom genetischen Hintergrund 97
Abbildung 42: Überlebenswahrscheinlichkeit der spastische* Population in Abhängigkeit vom genetischen
rünteegrund
AbbSdung 43:/«*/«»tf einer spastischen Maus der Zucht C57BL/6J G***/» xFi(C57BL/6J x OH/HeJ;
GW**) und eines gesunden Geschwistertieres zum Zeitpunkt P22 99
Abbildung 44: Unterschiede in der Schrittlange zwischen adulten ipastiidm Tieren und ihren gesunden
Wikltypgeschwisfcrn 100
Abbildung 45: Quantitative GMtWiMtyr Trarakriptmctigcn-rkstirnrnung im Rückenmark spasäsdxrTlcxc in
Abhängigkeit vom genetischen Hintergrund 101
Abbildung 46: G4*-Wildtyp-Trantknt tmcngCTi dei »nrttsA» lndrriduen unter Berüdaichngung der
Gruppen-Zugehörigkeit -, .Mtt
Abbildung 47: Mapping-Studie am Beispiel von Dl 1MTT39 105
Abbildung 48: Genkarte von Chromosom 11 im Bereich von 48 und 50 cM 106
Abbildung 49: MALDI-TOF-Massenspektrum und SNP-Auswertung von Clk2 (rsl3468134) 108
Abbildung 50: MALDI-TOF-Massenspektrum und SNP-Auswertung von PlbpZ Intron 7 (rs31269799) 109
Abbildung 51: MALDI-TOF-Massenspektrum und SNP-Auswertung von Plbp2 Intron 10 (rsl3477369) 110
Abbildung 52: MALDI-TOF-Massenspektrum und SNP-Auswertung von Afc,//5/(rsl3478486) 111
Abbildung 53: MALDI-TOF-Massenspektrum und SNP-Auswertung von DuspU (rs13459132) 112
Abbildung 54: MALDI-TOF-Massenspektrum und SNP-Auswertung von SfrsIS (rsl3468134) 113
Abbildung 55: Struktur des GW^ -Gens und seine Spleißvarianten 114
Abbildung 56: GA*-Transkriptverteilung im Rückenmark von Wildtypen und GW^^-Tieren verschiedener
Mauslinien 115
Abbildung 57: GA6-Minigentranskfipte im in Htv-Zellkulrurassay 115
Abbildur^58:KlorliertelJ^/E^Frag^nente^litzugerlörigenSa^lltturbereicnen 117
Abbildung 59: Einfluß der IJZVE/-Fragmente auf das GM-Spleißen im in niv-Zellkulturassay 118
Abbildung 60: Monierte IJT ffi/-Verkürzungsvarianten rntt zugehör^ Strukturbereichen 118
Abbildung 61: Einfluß der LJNE1- Verkurzungsvarianten auf das GW-Spleißen im M »Ä»-Zellkulturassayll9
Abbildung 62: Einfluß der ILCVEf-Deletionsvarianten ohne SeouenzdupHkation auf das GA*-Spleißen im «r
iiio-Zcllkulturassay 120
AbbiWung63:tjnflußvonORF2aufdasG/H -SnkißcnimMMw-Zcllkulairassay 122
Abbildung 64: Darstellung des Exon-Tausches zwischen den B6- und OHMmigencn 123
Abbildung 65: Auswirkung des MausKnien-spezifischen Hintergrundes auf das Gi^Spleißen im i* tno-
Zellkulturassay 123
Abbildung 66: MALDI-TOF-Massenspektrum und SNP-Auswertung von GA* Exon 6 («13477223) 125
Abbildung 67: Sequenzen und Modell der prognostizierten Bindratellen für Exon 6 des G*W5cn» 127
vi
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 68: Versuchsaufbau der RNA-Pull-Down Analyse 128
Abbildung 69: Nachweis der ASF/SF2-Interaktion mit der GW Exon 5 RNA 130
Abbildung 70: Interaktion der SRp-Proteinfamilie mit der GW Exon 5 RNA 131
Abbildung 71: Nachweis der hnRNP D-Interaktion mit der Ghb Exon 5 RNA 132
Abbildung 72: Nachweis der Interaktion von TIAL mit der GH Exon 5 RNA 132
Abbildung 73: Modell der prognostizierten Bindestellen für die Exon 6-RNA des GW Jens 133
Abbildung 74: Coomassie-Färbung des Pull-Downs der RNA von Exon 6 des GH-Gens 134
Abbildung 75: Nachweis der ASF/SF2-Interaktion mit der GH Exon 6 RNA 135
Abbildung 76: SRp-Bindung an die GH Exon 6 RNA 136
Abbildung 77: Nachweis der hnRNP D-Bindung an die RNA von Exon 6 des GH-Gens 137
Abbildung 78: Nachweis der Interaktion zwischen der GH Exon 6 RNA und TIAL 138
Abbildung 79: GH Exon 6 RNA-Interaktion mit C14orfl66 139
Abbildung 80: Transkriptvarianten von ASF/SF2 und GH verschiedener Mauslinien in Herz und
Rückenmark 141
Abbildung 81: ASF/SF2-Expression im Cortex unterschiedlicher Mausstämme 143
Abbildung 82: Einfluß von ASF/SF2 auf das Spleißverhalten von GH im in wio-Zellkulturassay 144
Abbildung 83: Densiometrische Quantifizierung der GW-Transkripte nach ASF/SF2-Koexpression im in
am Zellkultur-Assay 145
Abbildung 84: Akkumulation aller GW-Transkripte nach Emetin-Gabe im in mo-Zellkulturassay 147
Abbildung 85: Densiometrische Quantifizierung der GW-Transkripte nach Emetin-Gabe im in m*
Zellkultur-Assay 147
Abbildung 86: Densiometrische Quantifizierung des Einflusses des Lösungsmittels DMSO auf die GH-
Transkription im in mp-Zellkulturassay 151
Abbildung 87: Densiometrische Quantifizierung des Einflusses des Lösungsmittels Ethanot auf die GW-
Transkription im in mv-Zellkultur-Assay 152
Abbildung 88: Natrium-Vanadat-Wirkung auf die GW-Transkription im in töe-Zdlkuhurassay 153
Abbildung 89: Densiometrische Quantifizierung der GW-Transkripte nach Natrium-Vanadat-Gabe im m m»
-Zellkultur-Assay 154
Abbildung 9fr. Wirkung von Natrium-Butyrat auf die GW-Transkription im in ino-Zellkulturassay 155
Abbildung 91: Densiometrische Quantifizierung der GW-Transkripte nach Natrium-Bulyrat-Gabe im in mv-
Zellkultur-Assay 155
Abbildung 92: Wirkung von Cycloheximid auf die GW-Transkription im in uw-Zellkulturassay 156
Abbildung 93: Densiometrische Quantifizierung der GW-Transkripte nach CHX-Gabe im in m»-Zellkultur-
Assay 157
Abbildung 94: Gentamkin Einfluß auf die GW-Transkription im ;« mo-Zcllkulturassay 158
Abbildung 95: Densiometrische Quantifizierung der GW-Transkripte nach Gentamkin-Gabe im m im-
Zeükultur-Assay 159
Aboikiung %: Einfluß vmAcborramyanA auf die CA^Tramkriptkxi im/» nio-Zellkulturassay 160
Abbildung 97: Densiometrische Quantifizierung der Aclacinomycin A-Wirkung im in n«-Zdlkultur-Assay
161
Abbildung 98: Trichostarin A-Einfluß auf die GW-Transkription im in «w-ZHIkulnirassay 162
Abbildung 99: Densiometrische Quantifizierung des negativen TSA-Effektts im »iro-Zdlkultur-AsKqr 163
vä
AbbUdungvcrgichttis
Abbildung 100: Modell der prognostizierten RNA-Protein-Interakrion in Bezug auf die Bindestellen im
Exon 6 von GH W
Abbildung 101: pRK7-Expressionvektor von Addgene X
Abbildung 102; pEGFP-Ni-Expressk nvektor von aontech X
Abbildung 103: pcDNA3-Expressionsvektor von Invitrogen XI
Abbildung 104: pBluescript SK(-)-Expressk)nsvektor von Stratagene XI
Abbildung 105: pCR2-l-TOPO-Expressionsvektor von Invitrogen XII
AbbUdung 106: pCR XL TOPO von Invitrogen XII
Abbildung 107: J/w-Minigen (C57BL/6J) XIII
Abbildung 108: WT-Minigen (C3H/HeJ) XIII
Abbildung 109: XXO^Minigen (QH/HeJ) + ^-Schnittstelle XIV
Abbildung 110: WT-Minigen (langes Intron 4 von genomischer C57BL/6J-DNA) in # 351 (C3H/HeJ) XIV
Tabelle 1: Humane Glycin-Rezeptor-Mutationen 6
Tabelle 2: Übersicht über die Rezeptor-Familien 15
Tabelle 3: Funktionen der einzelnen Strukturelemente 19
Tabelle 4: Chromosomale Lokalisation der humanen und murinen GlyR-Untereinheiten 20
Tabelle 5: Übersicht über die Merkmale der verschiedenen Retroposons 32
Tabelle 6: Spontanmutationen des GlyR im Mausmodell 35
Tabelle 7: Pipettierschema für die Reverse Transkription 51
Tabelle 8: Pipettierschema einer Standard-PCR mit zugehörigen Zyklusangaben 52
Tabelle 9: DNA-Auftrennungsbereiche bei unterschiedlicher Agarose-Konzentration 54
Tabelle 10: DNA-Auftrennungsbereiche von PAA-Gelen unterschiedlicher Konzentration 55
Tabelle 11: Pipettierschema eines Restriktionsverdaus 59
Tabelle 12: Pipettierschema einer Dephosphorylierung 60
Tabelle 13: Pipettierschema eines ligationsansatzes 61
Tabelle 14: Pipettierschema eines Sequenzier-Ansatzes mit zugehörigen Zyklusangaben 63
Tabelle 15: Pipettieransatz und Zyklusangaben einer LightCycler-Reaktion 66
Tabelle 16: Pipettierschema und Zyklenangaben der Primär-PCR für die SNP-Analyse mit MALDI-TOF-
MS 70
Tabelle 17: Pipettierschema für einen Extensions-PCR-Ansatz mit zugehörigen Zyklenangaben für die SNP-
Analyse mit MALDI-TOF-MS 71
Tabelle 18: Pipetnerschema für die PCR zum SMRV-Nachweis mit zugehörigen Zyklusangaben 78
Tabelle 19: Verdauansatz für die Linearisierung des Plasmids 82
Tabelle 20: Pipettierschema für die T7-Transkription 82
Tabelle 21: Pipettierschema für die Aktivierung des HeLa-Kemextrakts 84
Tabelle 22: Spastische Zuchtlinien 91
Tabelle 23: Kreuzungsschetna zur Generierung von Phänotypen 92
Tabelle 24: Verwendete MikrosateEtenmarker für mapping-Analysen 103
viii
Abbildungsver%eicbnis
Tabelle 25: Allelhäufigkeit der spastischen Populationen an der Position D11M1T39 104
Tabelle 26: Kandidatengene mit kodierenden SNPs 106
Tabelle 27: Verwendete Glrb-Minigen-Basiskonstrukte 116
Tabelle 28:1JNE/-Fragmentkonstruktc in dem G/rb-CM I-Wildtyp-Minigen #353 117
Tabelle 29: LINE 7-Deletionskonstrukfe in G/rb-CM I-Wildtyp-Minigenen 118
Tabelle 30:1JNE/-DeletionsVariante ohne zusätzliche Repeat-Sequenz im GA -C3H-Wildtyp-Minigen 119
Tabelle 31: Klonierte UNEt-OKF s in Expressionsvektoren 121
Tabelle 32: Klonierte UNEJ-ORF 2 -Fragmente im G/^C3H-Wildtyp-Vektor 122
Tabelle 33: Kodierende SNPs im G/rb-Gcn 124
Tabelle 34: Splcißfaktorbindcstcllen in Glrb Kxon 5 und 6 126
Tabelle 35: Übersicht der im in /»/o-Zcllkulturassay verwendeten Wirkstoffe 149
Tabelle 36: Veränderung der GA^-Transkripte bei Natrium-(ortho-)Vanadat- Behandlung 153
Tabelle 37: Veränderung der G// -Transkripte bei Natrium-Butyrat-Behandlung 156
Tabelle 38: Cycloheximid-Effekt auf die GW-Spleißvarianten 157
Tabelle 39: Effekt von Gentamicin auf die GA£-Spleißvariantcn 159
Tabeüe 40: Effekt der Aclacinomycin A-Gabe auf die G^-Spleißvarianten 161
Tabelle 41: Effekt von TSA auf die G/^-Spleißvananten 163
Tabelle 42: Übersicht über die verwendeten Wirkstoffe und ihre Wirkungsweise auf das GAA-Spleißen 164
Tabelle 43: Übersicht über die hergestellten bzw. verwendeten Vektoren und Minigene IX
Tabelle 44: Übersicht über die verwendeten Antikörper XX
ix
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| adam_txt |
Titel: Die hypertone Bewegungsstörung der Mausmutante Spastic
Autor: Braune, Marlen
Jahr: 2008
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
ZUSAMMENFASSUNG 1
SUMMARY 2
einleitung 5
1. hyperekplexie 5
2. Struktur und Funktionsweise des Nervensystem 7
2.1 Gliederung des Nervensystems 7
2.2 entwicklung des nervensystems 8
2.3 Neuronale Plastizität 9
2.4 Bausteine des Nervensystems 9
2.5 DlESYNAPSE 12
2.6 Membrankanäle 14
2.7 neurotransmitter 16
3. Der inhibitorische Glycin-Rezeptor 17
3.1 Allgemeines 17
3.2 Struktur und Funktionsweise 17
3.3 LlGANDENBINDUNG 21
4. Von der DNA zum Protein 23
4.1 DlEDNA 23
4.2 DlEDNA ALSM41WZE 24
4.3 MRNA-PROZESSIERUNG 25
4.3.7 Spleißen 27
4.3.2 DasSpleißosom 27
4.3.3 Die Molekularbiologie des Spleißens 28
4.3.4 Chemische Vorgänge 29
4.3.5 SR-Proteine und hnRNPs 30
4.4 retroposonsimGenom 31
5. Das Mausmodell 34
j.7 glycin-rezeptor-defiziente mause 34
5.2 die spastische maus 35
6. Ziele der Arbeit 38
material und methoden 4j
7. Material 41
7.1 Bakterien 41
7.2 Chemikalien 42
7.2.1 Allgemeine Chemikalien 42
7.2.2 Spezielle Chemikalien 43
7.3 DNA-GROßENMARKER 44
7.4 Enzyme 44
7.5 GERATE 45
7.6 ougonuklbotide 47
7.7 Vektoren 47
7.« Verbrauchsmaterialien 47
7.9 Versuchstiere 48
7.70 zellkulturen 48
8. Molekularbiologische Methoden 49
Ä7 RNA-PRÄPARATION 49
i
Inhaltsverzeichnis
8.2 CDNA-SYNTHESE (REVERSETRANSKRIPTION) 50
8.3 POLYMEMASE-KETTEN-REAKTION (PCR) 51
8.4 ElIXTROPHORETISCHEDNA-AUFTRENNUNG 53
8.4.1 Agarose-Geie 53
8.4.2 Polyacrylamid-Gele 55
8.5 DNA-PRÄPARATION 56
8.5.1 Präparation von kleinen Mengen Plasmid-DNA (Mini-Präp) 56
8.5.2 Präparation von größeren Mengen Plasmid-DNA (Maxi-Präp) 57
8.5.3 Praparation von den DNA aus Agarose-Gelen und PCR-Ansätzen 58
8.5.4 Isolierung von Mausschwanz-DNA 58
8.6 DNA-MOD1F1ZIERENDE METHODEN 58
8.6.1 Restriktionsverdau 58
8.6.2 Dephosphorylierung 60
8.6.3 Ligation 60
8.7 TRANSFORMATION 61
8.8 SEQUENZIERUNG NACH SANGER 63
8.9 REAL-T1MEQUANTITATIVEPCR(RTQ-PCR} 64
8.10 MAWI-TOF-MS 68
9. Zellbiologische Methoden 72
9.1 anlegen vonmurinenastrozyten-kulturen 72
9.2 kultivierung vonädhäsjonszei£en 73
9.3 transfektionvonzeixen 74
9.3.1 Calcium-Phosphat-Transfektion 75
9.3.2 Liposomale Transfektion 76
9.4 NACHWEIS VON SMRV-KONTAMNATIONEN IN ZELLKULTUREN 77
9.4.1 Nachweis des Provirus 78
9.4.2 Nachweis replikativer Viren 79
10. proteinbiochemische Methoden 81
10.1 rna-puij.-downassay 81
10.2 COOMASSIE-BRILUANT-BLAU 85
10.3 WesternBlotting 86
ERGEBNISSE 82
11. Phänotypische Charakterisierung der Mausmutante spastic 89
//./ Zuchtund Genotypisierung 90
11.2 Klassifizierung dermurinenHyperekplexie 93
11.3 EINFLUß des genetischen Hintergrundes 96
11.4 HypertoneBewegungsstörung 98
11.5 Glrb-Transkripimengen 1o°
12. Heterogenitätsuntersuchungen 1°3
12.1 Mapping der Hot Spot-Region l°3
12.2 SNP-ANALYSEMITMALDl-TOF-kß 1°5
12.2.1 SNP-Analyse von Clk2 1°7
12.2.2 SNP-Analyse von Ptbp2 l09
12.2.3 SNP-AnalysevonMedl3l/Thrap2 '"
12.2.4 SNP-Analyse von Duspl4 "2
12.2.5 SNP-Analyse von SfrslS "3
13. G/J8B-SPLEIBPATBOMECHANISMIIS l*4
13.1 MINIGENKONSTRUKTION "6
13.2 EINFLUß DER LÄNGE VONLINE1 AUF DASGLRB-SPLEIßEN "7
13.3 FUNKTIONAJJTAT DER LINE1-ORFS 12°
13.4 LINEUNABHÄNGIGKEIT VOMMiNIGEN-HINTERGRUND I23
13.5 SEQUENZIERUNG UNDDATENBANKABGLE1CHDER GLRB-KONSTRUKTE 124
13.6 SNPSMGLRB-GEN 125
ii
Inhaltsverzeichnis
13.7 einfluß derglrb-snps auf die eses 126
14. Gläb-RNA-Interaktion mit Zellkernproteinen 128
14.1 rna-pull-down-assayvonglrbexon5 129
14.1.1 Interaktionsnachweis von GlrbExon 5 mit ASF/SF2 130
14.1.2 Bindeverhalten der SRp-Familie 130
14.1.3 Assoziation mit der Familie der hnRNPs 131
14.1.4 Bindeverhalten von TIAL1 132
14.2 KNA-PULL-EK mi-ASSAYVONExON6 133
14.2.1 ASF/SF2-Bindung an die G/rA Exon 6-RNA 134
14.2.2 Interaktion der SR-Proteine mit der Glrb Exon 6-RNA 135
14.2.3 Glrb Exon 6-RNA-Bindung an die hnRNPs 136
14.2.4 Exon 6-Interaktion mit TIAL1 137
14.2.5 C14orfl66-Interaktion mit der Glrb Exon 6-RNA 138
15. ASF/SF2 EIN POTENTIELLER GiÄB-SPLEIBMODULATOR 140
15.1 Mauslinien- und Gewebe-spezifische Transkription von ASF/SF2 141
15.2 ASF/SF2-ExPRESsioNin Gewebe 142
15.3 ASF/SF2lMINVIVOSPLEIßASSAY 143
15.4 Emetin-Assay: Nonsensemediated decayderGlrb-Transkripte 145
16. elnfluo kleiner moleküle auf das giäb-transkriptlonsmuster 149
16.1 wildtyptranskript erhöhende substanzen 152
16.1.1 Natrium-(ortho-) Vanadat 152
16.1.2 Natrium-Butyrat 154
16.1.3 Cycloheximid 156
16.1.4 Gentamicin 158
16.2 CHEMIKALIEN, DIE DAS KONSTITUTIVE GLRB-SPLElßEN SUPRMEREN 159
16.2.1 Aclacinomycin A 159
16.2.2 Trichostatin A 161
16.3 Zusammenfassungderwirkstoffanalyse 163
diskussion 165
17. Ausprägung des spastischen Phänotvps in Abhängigkeit vom genetischen
Hintergrund 166
17.1 die spastische zucht 166
17.2 Ausprägung der hyperTonen Bewegungsstörungen 167
17.3 DiephAnotypischeVariabiutätinZusammenhang mitdemGenotyp 167
17.4 die rolle derglycin-rezeptor ß-unterelnheit 170
18. ElNFLUiDESi//VE/-ELEMENTESAUFDENCtÄB™ -SPLEiaPATHOMECHANISMUS 172
18.1 DIE MINIGENKONSTRUKTION UND KWN1ERUNGSARTEFAKTE 172
18.2 EmFWßDERUNEl-STRUKTURELEMENTEAUFDASGLRB-SPLElßEN 173
18.3 Diebedeutung derunei-ORF's 174
19. Die Modulation des spastischen Phänotvps 175
19.1. die suche nach dem modulator auf dna-niveau 175
19.2. die veränderte protein-rna-1n1eraktion 175
19.3. Expressionsprofil der potentiellen Kandidaten 177
19.4. wirkung derputatwenmodulatoren imzellkulwr-modell 177
19.5. snp-analyse der kandidatengene 178
19.6. die rolle des ess in exon 6 von glrb 178
2a Dm Rolle von ASF/SF2 beim Gljw-Spleiien 181
20.1. Interaktion von ASF/SF2 mitderGlrb-RNA 181
20.2 EINFLUß IM IN VTVO-ZELLKULTUR-SYSTEM 182
20.3. Auswirkung vonPolymorphismenaufPhosphoryuerung und Aktivität vonASF/SF2 183
20.4. ASF/SF2-AUTOREGUUTION: TRANSKRIPTIONS- UNDEXPRESSIONaMSTER 184
21. Therapuansatz 186
22. Ausblick 188
ii
22.1. DIE SUCHE NACH DEM MODULATOR l88
212. RtSCVEDESSPASTtSCHENPHANOTYPS l89
22.3. ZUSÄTZLICHE PHANOTYPISCHE ANALYSEN 19°
224. OFFENE FRAGESTELLUNGEN 191
UTERATtntVFBTPirHTJlS 121
23. literatur 193
23.1 Referenzen 193
23.2 verwendete bücher 206
ANHANG I
24. Abkürzungen I
24.1. Verwendete Abkürzungen I
2*2. PHYSIKALISCHE GRÖßEN II
2*3. GRIESCH/SCHES ALPHABET III
2*-/. ivpac-cox in
2*5. AMSNOSAUKE-BEZBCHNUNGEN IV
25. GUW^EQUIHZEN V
2AA C57BU6JSBSUENZ V
25.2. C3H/HEJSEQUENZ Vjk
26. KONSTOUKIX Vfflf *
2 A MWXiENKOtiSnWKTE VIII
2 2. GenkartenDmvERWENDETENExPRESsioNsvExroREN X
26.3. GENKARTEN DERVERmNDETENBASlS-MlNIGENKONSTRUKTE XIII
27. OuGONinaEorrmsEQVENZEN XV
27./. MUTAGENESE-PRIMER XV
27.5. GENOTYP1SIERUNGS-PRIMER XVIII
27.6. „MAPPING"-PRMER XVm
27.7. PRIMER FÜR DIE SNP-ANALYSE XIX
27.8. PRIMER FOR DEN SMRV-NACHWE1S XIX
28. Antikörper XX
DANKSAGUNG XH
iv
Abbildungver ichnis
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Nummer Seite
Abbildung 1: Aufbau des menschlichen ZNS 7
Abbildung 2: Die Stadien der Neurulation. 8
Abbildung 3: Motphologie verschiedener Neurontypen 9
Abbildung 4: Bau eines Neurons 10
Abbildung 5: Bau der Gliazellen 11
Abbildung 6: Funktion der Astrozyten 12
Abbildung 7: Vorgänge an der chemischen Synapse 13
Abbildung 8: Bau der elektrischen Synapse 14
Abbildung 9: Isoformen des murinen Glycin-Rezeptors 18
Abbildung 10: Domänenstruktur und Signalsequenzen der alpha-UE 18
Abbildung 11: Spleißvarianten der aj-Untereinheiten des Glycin-Rezeptors 20
Abbildung 12: Struktur der Agonisten und Afltagonisten des Glycin-Rezeptors 21
Abbildung 13: Funktionsweise der glycinergen Synapse 22
Abbildung 14: Verpackung der DNA in Chromosomen 23
Abbildung 15: Der Vorgang der Replikaoon 24
Abbildung 16: Ablauf der Transkription und Translation 25
Abbildung 17: mRNA-Prozessierungsvorgänge 26
Abbildung 18: Übersicht über die Konsensussequenzen 28
Abbildung 19: Die Komponenten des Spleißosoms und der Ablauf des Spleiß-Vorgangs 29
Abbildung 20: Lariat-Bildung und chemische Reaktionsabläufe während des Spleißens 30
Abbildung 21: Bau der verschiedenen Retroposon-Familien 33
Abbildung 22: Struktur des GA**"-Gens und seine Spleißvarianten 36
Abbildung 23: Vergleich spastudxrVhmotmcn Ghifflf (links) mit gesunden Mäusen (rechts) beim Taü-Test
37
Abbildung 24: DNA-Größenmarker. 44
Abbildung 25: Aufbau eines LightCyclers und der verwendete Glaskapillaren 65
Abbildung 26: Graphische Darstellung der IightCycler-Absorpnonsmessijng 66
Abbildung 27: Prinzip des MALDI (Matrix-Assisted-Lascr-Desorption/Ionizanon) 68
Abbildung 28: Flugzcitamlyse^iMt-o/^fTOF) von RcmcJekülen 69
Abbildung 29: Massenspektrum einer MALDI-TOF-Massenspektrometrie 69
Abbildung 30: Arbeitsschema für den SMRV-Nachweis Queue: ZKBS 77
Abbildung 31: Ergebnis des proviralen SMRV-Nachweises 79
Abbildung 32: Nachweis repHkativer SMR-Viren 80
Abbadung 33: Versuchsaufbau der RNA-PuB-Down Analyse 81
Abbildung 34: Genotypisierung 91
v
,1
MbilimgmitiAms
Abbildung 35: Jahreszeitabhängige Zuchtcrfolge 9Z
Abbildung 36: Anzahl aller Phänotypen W
Abbadung 37: Gewichtsproö von Mäusen einer C57BL/6J GW'f x C57BL/6J GH"* -Verpaarung 94
Abbildung 38: Gewichtsverlauf und Größenunterschied der Tiere eines Wurfes "*
Abbildung 39: Taü-Test .puO fer Phänotypen GM#4f (links) im Vergleich zu gesunden Mäusen (rechts) 95
Abbildung 40: Darstellung des .Jon i^rifhlmng" eines spaslixbtn Phänotyps 95
Abbildung 41: Gewichtsprofil der ^uatatar Population in Abhängigkeit vom genetischen Hintergrund 97
Abbildung 42: Überlebenswahrscheinlichkeit der spastische* Population in Abhängigkeit vom genetischen
rünteegrund
AbbSdung 43:/«*/«»tf einer spastischen Maus der Zucht C57BL/6J G***/»"xFi(C57BL/6J x OH/HeJ;
GW**) und eines gesunden Geschwistertieres zum Zeitpunkt P22 99
Abbildung 44: Unterschiede in der Schrittlange zwischen adulten ipastiidm Tieren und ihren gesunden
Wikltypgeschwisfcrn 100
Abbildung 45: Quantitative GMtWiMtyr Trarakriptmctigcn-rkstirnrnung im Rückenmark spasäsdxrTlcxc in
Abhängigkeit vom genetischen Hintergrund 101
Abbildung 46: G4*-Wildtyp-Trantknt tmcngCTi dei »nrttsA» lndrriduen unter Berüdaichngung der
Gruppen-Zugehörigkeit ' -, .Mtt
Abbildung 47: Mapping-Studie am Beispiel von Dl 1MTT39 105
Abbildung 48: Genkarte von Chromosom 11 im Bereich von 48 und 50 cM 106
Abbildung 49: MALDI-TOF-Massenspektrum und SNP-Auswertung von Clk2 (rsl3468134) 108
Abbildung 50: MALDI-TOF-Massenspektrum und SNP-Auswertung von PlbpZ Intron 7 (rs31269799) 109
Abbildung 51: MALDI-TOF-Massenspektrum und SNP-Auswertung von Plbp2 Intron 10 (rsl3477369) 110
Abbildung 52: MALDI-TOF-Massenspektrum und SNP-Auswertung von Afc,//5/(rsl3478486) 111
Abbildung 53: MALDI-TOF-Massenspektrum und SNP-Auswertung von DuspU (rs13459132) 112
Abbildung 54: MALDI-TOF-Massenspektrum und SNP-Auswertung von SfrsIS (rsl3468134) 113
Abbildung 55: Struktur des GW^"-Gens und seine Spleißvarianten 114
Abbildung 56: GA*-Transkriptverteilung im Rückenmark von Wildtypen und GW^^-Tieren verschiedener
Mauslinien 115
Abbildung 57: GA6-Minigentranskfipte im in Htv-Zellkulrurassay 115
Abbildur^58:KlorliertelJ^/E^Frag^nente^litzugerlörigenSa^lltturbereicnen 117
Abbildung 59: Einfluß der IJZVE/-Fragmente auf das GM-Spleißen im in niv-Zellkulturassay 118
Abbildung 60: Monierte IJT\ffi/-Verkürzungsvarianten rntt zugehör^ Strukturbereichen 118
Abbildung 61: Einfluß der LJNE1- Verkurzungsvarianten auf das GW-Spleißen im M »Ä»-Zellkulturassayll9
Abbildung 62: Einfluß der ILCVEf-Deletionsvarianten ohne SeouenzdupHkation auf das GA*-Spleißen im «r
iiio-Zcllkulturassay 120
AbbiWung63:tjnflußvonORF2aufdasG/H -SnkißcnimMMw-Zcllkulairassay 122
Abbildung 64: Darstellung des Exon-Tausches zwischen den B6- und OHMmigencn 123
Abbildung 65: Auswirkung des MausKnien-spezifischen Hintergrundes auf das Gi^Spleißen im i* tno-
Zellkulturassay 123
Abbildung 66: MALDI-TOF-Massenspektrum und SNP-Auswertung von GA* Exon 6 («13477223) 125
Abbildung 67: Sequenzen und Modell der prognostizierten Bindratellen für Exon 6 des G*W5cn» 127
vi
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 68: Versuchsaufbau der RNA-Pull-Down Analyse 128
Abbildung 69: Nachweis der ASF/SF2-Interaktion mit der GW Exon 5 RNA 130
Abbildung 70: Interaktion der SRp-Proteinfamilie mit der GW Exon 5 RNA 131
Abbildung 71: Nachweis der hnRNP D-Interaktion mit der Ghb Exon 5 RNA 132
Abbildung 72: Nachweis der Interaktion von TIAL mit der GH Exon 5 RNA 132
Abbildung 73: Modell der prognostizierten Bindestellen für die Exon 6-RNA des GW Jens 133
Abbildung 74: Coomassie-Färbung des Pull-Downs der RNA von Exon 6 des GH-Gens 134
Abbildung 75: Nachweis der ASF/SF2-Interaktion mit der GH Exon 6 RNA 135
Abbildung 76: SRp-Bindung an die GH Exon 6 RNA 136
Abbildung 77: Nachweis der hnRNP D-Bindung an die RNA von Exon 6 des GH-Gens 137
Abbildung 78: Nachweis der Interaktion zwischen der GH Exon 6 RNA und TIAL 138
Abbildung 79: GH Exon 6 RNA-Interaktion mit C14orfl66 139
Abbildung 80: Transkriptvarianten von ASF/SF2 und GH verschiedener Mauslinien in Herz und
Rückenmark 141
Abbildung 81: ASF/SF2-Expression im Cortex unterschiedlicher Mausstämme 143
Abbildung 82: Einfluß von ASF/SF2 auf das Spleißverhalten von GH im in wio-Zellkulturassay 144
Abbildung 83: Densiometrische Quantifizierung der GW-Transkripte nach ASF/SF2-Koexpression im in
am Zellkultur-Assay 145
Abbildung 84: Akkumulation aller GW-Transkripte nach Emetin-Gabe im in mo-Zellkulturassay 147
Abbildung 85: Densiometrische Quantifizierung der GW-Transkripte nach Emetin-Gabe im in m*
Zellkultur-Assay 147
Abbildung 86: Densiometrische Quantifizierung des Einflusses des Lösungsmittels DMSO auf die GH-
Transkription im in mp-Zellkulturassay 151
Abbildung 87: Densiometrische Quantifizierung des Einflusses des Lösungsmittels Ethanot auf die GW-
Transkription im in mv-Zellkultur-Assay 152
Abbildung 88: Natrium-Vanadat-Wirkung auf die GW-Transkription im in töe-Zdlkuhurassay 153
Abbildung 89: Densiometrische Quantifizierung der GW-Transkripte nach Natrium-Vanadat-Gabe im m m»
-Zellkultur-Assay 154
Abbildung 9fr. Wirkung von Natrium-Butyrat auf die GW-Transkription im in ino-Zellkulturassay 155
Abbildung 91: Densiometrische Quantifizierung der GW-Transkripte nach Natrium-Bulyrat-Gabe im in mv-
Zellkultur-Assay 155
Abbildung 92: Wirkung von Cycloheximid auf die GW-Transkription im in uw-Zellkulturassay 156
Abbildung 93: Densiometrische Quantifizierung der GW-Transkripte nach CHX-Gabe im in m»-Zellkultur-
Assay 157
Abbildung 94: Gentamkin Einfluß auf die GW-Transkription im ;« mo-Zcllkulturassay 158
Abbildung 95: Densiometrische Quantifizierung der GW-Transkripte nach Gentamkin-Gabe im m im-
Zeükultur-Assay 159
Aboikiung %: Einfluß vmAcborramyanA auf die CA^Tramkriptkxi im/» nio-Zellkulturassay 160
Abbildung 97: Densiometrische Quantifizierung der Aclacinomycin A-Wirkung im in n«-Zdlkultur-Assay
161
Abbildung 98: Trichostarin A-Einfluß auf die GW-Transkription im in «w-ZHIkulnirassay 162
Abbildung 99: Densiometrische Quantifizierung des negativen TSA-Effektts im »iro-Zdlkultur-AsKqr 163
vä
AbbUdungvcrgichttis
Abbildung 100: Modell der prognostizierten RNA-Protein-Interakrion in Bezug auf die Bindestellen im
Exon 6 von GH W
Abbildung 101: pRK7-Expressionvektor von Addgene X
Abbildung 102; pEGFP-Ni-Expressk nvektor von aontech X
Abbildung 103: pcDNA3-Expressionsvektor von Invitrogen XI
Abbildung 104: pBluescript SK(-)-Expressk)nsvektor von Stratagene XI
Abbildung 105: pCR2-l-TOPO-Expressionsvektor von Invitrogen XII
AbbUdung 106: pCR XL TOPO von Invitrogen XII
Abbildung 107: J/w-Minigen (C57BL/6J) XIII
Abbildung 108: WT-Minigen (C3H/HeJ) XIII
Abbildung 109: XXO^Minigen (QH/HeJ) + ^-Schnittstelle XIV
Abbildung 110: WT-Minigen (langes Intron 4 von genomischer C57BL/6J-DNA) in # 351 (C3H/HeJ) XIV
Tabelle 1: Humane Glycin-Rezeptor-Mutationen 6
Tabelle 2: Übersicht über die Rezeptor-Familien 15
Tabelle 3: Funktionen der einzelnen Strukturelemente 19
Tabelle 4: Chromosomale Lokalisation der humanen und murinen GlyR-Untereinheiten 20
Tabelle 5: Übersicht über die Merkmale der verschiedenen Retroposons 32
Tabelle 6: Spontanmutationen des GlyR im Mausmodell 35
Tabelle 7: Pipettierschema für die Reverse Transkription 51
Tabelle 8: Pipettierschema einer Standard-PCR mit zugehörigen Zyklusangaben 52
Tabelle 9: DNA-Auftrennungsbereiche bei unterschiedlicher Agarose-Konzentration 54
Tabelle 10: DNA-Auftrennungsbereiche von PAA-Gelen unterschiedlicher Konzentration 55
Tabelle 11: Pipettierschema eines Restriktionsverdaus 59
Tabelle 12: Pipettierschema einer Dephosphorylierung 60
Tabelle 13: Pipettierschema eines ligationsansatzes 61
Tabelle 14: Pipettierschema eines Sequenzier-Ansatzes mit zugehörigen Zyklusangaben 63
Tabelle 15: Pipettieransatz und Zyklusangaben einer LightCycler-Reaktion 66
Tabelle 16: Pipettierschema und Zyklenangaben der Primär-PCR für die SNP-Analyse mit MALDI-TOF-
MS 70
Tabelle 17: Pipettierschema für einen Extensions-PCR-Ansatz mit zugehörigen Zyklenangaben für die SNP-
Analyse mit MALDI-TOF-MS 71
Tabelle 18: Pipetnerschema für die PCR zum SMRV-Nachweis mit zugehörigen Zyklusangaben 78
Tabelle 19: Verdauansatz für die Linearisierung des Plasmids 82
Tabelle 20: Pipettierschema für die T7-Transkription 82
Tabelle 21: Pipettierschema für die Aktivierung des HeLa-Kemextrakts 84
Tabelle 22: Spastische Zuchtlinien 91
Tabelle 23: Kreuzungsschetna zur Generierung von Phänotypen 92
Tabelle 24: Verwendete MikrosateEtenmarker für mapping-Analysen 103
viii
Abbildungsver%eicbnis
Tabelle 25: Allelhäufigkeit der spastischen Populationen an der Position D11M1T39 104
Tabelle 26: Kandidatengene mit kodierenden SNPs 106
Tabelle 27: Verwendete Glrb-Minigen-Basiskonstrukte 116
Tabelle 28:1JNE/-Fragmentkonstruktc in dem G/rb-CM I-Wildtyp-Minigen #353 117
Tabelle 29: LINE 7-Deletionskonstrukfe in G/rb-CM I-Wildtyp-Minigenen 118
Tabelle 30:1JNE/-DeletionsVariante ohne zusätzliche Repeat-Sequenz im GA -C3H-Wildtyp-Minigen 119
Tabelle 31: Klonierte UNEt-OKF's in Expressionsvektoren 121
Tabelle 32: Klonierte UNEJ-ORF 2 -Fragmente im G/^C3H-Wildtyp-Vektor 122
Tabelle 33: Kodierende SNPs im G/rb-Gcn 124
Tabelle 34: Splcißfaktorbindcstcllen in Glrb Kxon 5 und 6 126
Tabelle 35: Übersicht der im in /»/o-Zcllkulturassay verwendeten Wirkstoffe 149
Tabelle 36: Veränderung der GA^-Transkripte bei Natrium-(ortho-)Vanadat- Behandlung 153
Tabelle 37: Veränderung der G// -Transkripte bei Natrium-Butyrat-Behandlung 156
Tabelle 38: Cycloheximid-Effekt auf die GW-Spleißvarianten 157
Tabelle 39: Effekt von Gentamicin auf die GA£-Spleißvariantcn 159
Tabeüe 40: Effekt der Aclacinomycin A-Gabe auf die G^-Spleißvarianten 161
Tabelle 41: Effekt von TSA auf die G/^-Spleißvananten 163
Tabelle 42: Übersicht über die verwendeten Wirkstoffe und ihre Wirkungsweise auf das GAA-Spleißen 164
Tabelle 43: Übersicht über die hergestellten bzw. verwendeten Vektoren und Minigene IX
Tabelle 44: Übersicht über die verwendeten Antikörper XX
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