Etablierung eines Aequorin-basierten Calcium-Influx-Assays und pharmakologische Charakterisierung natürlich vorkommender 5-HT 3A -Rezeptorvarianten und neuer 5-HT 3 -Rezeptoruntereinheiten:
Gespeichert in:
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2008
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A. Einleitung 1
1. Der Neurotransmitter Serotonin 1
2. Serotonin-Rezeptoren 2
3. Der 5-HT3-Rezeptor 3
3.1 Vorkommen und physiologische Funktion 3
3.2 Struktur 4
3.3 Pharmakologie 7
4. Zielsetzungen 10
4.1 Etablierung Aequorin-basierter Calcium-Influx-Assays 10
4.2 Funktionelle Untersuchung der Pro391 Arg- und der Arg344His-Variante
des h5-HT3A-Rezeptors 10
4.3 Pharmakologische Charakterisierung der putativen 5-HT3C-, 5-HT3D- und
5-HT3E-Rezeptoruntereinheiten 10
B. Material und Methoden 12
I.Material 12
1.1 Arbeitsgeräte 12
1.2 Verbrauchsmaterial 13
1.3 Computer-Software 14
1.4 Kits für die Molekularbiologie 15
1.5 Chemikalien 15
1.6 Radiochemikalien 17
1.7 Strukturformeln der verwendeten 5-HT3-Rezeptorliganden 18
1.8 Nährmedien für die Bakterienkultur 19
1.9 Puffer und Lösungen 19
1.10 Enzyme 21
1.11 Nukleinsäuren 22
1.12 Zelllinien 22
1.13 Vektoren 23
2. Methoden 25
2.1 Zellkulturmethoden 25
2.1.1 Kultivierung von HEK293-Zellen 25
2.1.2 Auftauen der Zellen 25
2.1.3 Mediumwechsel 25
2.1.4 Teilung der Zellkulturen 25
2.1.5 Einfrieren der Zellen 26
2.2 Molekularbiologische Methoden 26
2.2.1 Plasmid Mini-Präparation 26
2.2.2 Plasmid Mega-Präparation 26
2.2.3 DNA-Konzentrationsbestimmung 26
2.2.4 Horizontale Agarose-Gelelektrophorese 27
2.2.5 Isolierung von DNA aus Agarosegelen 28
2.2.6 Reinigung von DNA durch Phenol/Chloroform-Extraktion 28
2.2.7 Fällung von DNA mit Ethanol 28
2.2.8 Polymerasekettenreaktion (PCR) 29
2.2.9 Klonierungstechniken 30
2.2.9.1 Klonierung von PCR-Produkten 30
2.2.9.2 Restriktionsverdau von DNA 30
2.2.9.3 Ligation von DNA-Enden 31
2.2.9.4 Transformation kompetenter Bakterien 31
2.2.9.5 Anlegen von Bakterien-Dauerkulturen 32
2.2.10 DNA-Sequenzierung 32
2.2.11 Transiente Transfektion der Zellen 33
2.3 Biochemische Methoden 34
2.3.1 Proteinbestimmung nach Lowry 34
2.3.2 Proteinbestimmung mit dem DC-Proteinassay (Biorad) 34
2.3.3 Membranpräparation 34
2.4 Pharmakologische Methoden 35
2.4.1 Radioligandbindungsstudien 35
2.4.1.1 Theoretische Grundlagen 35
2.4.1.2 Durchführung der Radioligandbindungsstudien 37
2.4.2 Patch-Clamp Messungen 38
2.4.2.1 Messkonfigurationen 38
2.4.2.2 Versuchsaufbau 39
2.4.2.3 Durchführung der Patch-Clamp Messungen 41
2.4.2.4 Datenanalyse 41
2.4.3 Aequorin-Assays 42
2.4.3.1 Das Photoprotein Aequorin 42
2.4.3.2 Coelenterazin-Analoga 44
2.4.3.3 Durchführung der Aequorin-Assays 45
2.4.3.4 Datenanalyse 46
2.5 Statistische Auswertung 46
C. Ergebnisse 47
1. Etablierung einer Methode der Aequorin-basierten Calcium-Influx-Messung
an rekombinanten 5-HT3-Rezeptoren 47
2. Funktionelle Charakterisierung der natürlichen Rezeptorvarianten h5-HT3A
Pro391 Arg und hö-HT^ Arg^His 53
2.1 Elektrophysiologische Charakterisierung des rekombinanten h5-HT3A
Wildtyp-Rezeptors 55
2.2 Elektrophysiologische Charakterisierung der natürlichen
Rezeptorvariante h5-HT3A Pro391 Arg 56
2.2.1 Aktivierung des 5-HT3-vermittelten Natrium-Einstroms durch die 5-
HT3-Rezeptoragonisten 5-HT, mCPBG und 2-Methyl-5-HT 56
2.2.2 Hemmung des 5-HT-induzierten Natrium-Einstroms durch die 5-HT3-
Rezeptorantagonisten d-Tubocurarin und Azasetron 60
2.3 Funktionelle Charakterisierung der natürlichen Arg^His-Variante des
humanen 5-HT3A-Rezeptors 62
2.3.1 Aktivierung des 5-HT3-Rezeptor-vermittelten Calcium-Einstroms
durch die 5-HT3-Rezeptoragonisten 5-HT und mCPBG 62
2.3.2 Hemmung des 5-HT-induzierten Calcium-Einstroms durch die 5-HTä-
Rezeptorantagonisten Ondansetron und Azasetron 65
2.3.3 Einfluss des Arg344His-Aminosäureaustausches auf den
Maximaleffekt des Serotonins 67
3. Pharmakologische und funktionelle Charakterisierung der putativen 5-HT3C-,
5-HT3D- und 5-HT3E-Rezeptoruntereinheiten 68
3.1 Radioligandbindungsstudien 70
3.1.1 [3H]-GR65630-Bindung der putativen 5-HT3C-, 5-HT3D- und 5-HT3E-
Rezeptoruntereinheiten 70
3.1.2 [3H]-GR65630-Bindung nach Co-Transfektion der 5-HT3A/c-, 5-HT3A/d
-oder 5-HT3A/E-RezeP oruntereinheiten 70
3.2 Funktionelle Charakterisierung der putativen 5-HT3c-, 5-HT3D- und 5-
HT3E-Rezeptoruntereinheiten 72
3.2.1 Aktivierung des 5-HT3C-, 5-HT3d- und 5-HT3E-vermittelten Calcium-
Influx durch 5-HT 72
3.2.2 Agonist-induzierter Calcium-Influx nach Co-Transfektion der 5-
HT3a/c-, 5-HT3a/d- oder 5-HT3A/E-Rezeptoruntereinheiten 73
3.2.2.1 5-HT- bzw. mCPBG-induzierter Calcium-Influx 73
3.2.2.2 Hemmung des 5-HT-induzierten Calcium-Influx durch die 5-HT3-
Rezeptorantagonisten Ondansetron und Azasetron 75
3.2.2.3 Einfluss der zusätzlichen Expression der 5-HT:sc-, 5-HT3d- und
5-HT3E-Rezeptoruntereinheiten auf den Maximaleffekt des 5-HT 80
D.Diskussion 81
1. Etablierung Aequorin-basierter Calcium-Influx-Assays 81
2. Funktionelle Charakterisierung der h5-HT3APro391Arg- und der h5-
HTaAArg^His-Variante des h5-HT3A-Rezeptors 85
2.1 Funktionelle Charakterisierung des h5-HT:3APro391Arg-Rezeptors 86
2.2 Funktionelle Charakterisierung des hS-HTwW^His-Rezeptors 88
3. Charakterisierung der putativen 5-HT3c-, 5-HT3D- und 5-HT3E-
Rezeptoruntereinheiten 90
E. Zusammenfassung 95
F. Literaturverzeichnis 98
G. Eigene Veröffentlichungen 106
H.Anhang 107
1. Klonierung des genomischen 5 -Bereiches des humanen 5-HTsA-Rezeptors. 107
2. Subklonierung der Promotorfragmente in den pGL3 Basic-Vektor 109
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Inhaltsverzeichnis
A. Einleitung 1
1. Der Neurotransmitter Serotonin 1
2. Serotonin-Rezeptoren 2
3. Der 5-HT3-Rezeptor 3
3.1 Vorkommen und physiologische Funktion 3
3.2 Struktur 4
3.3 Pharmakologie 7
4. Zielsetzungen 10
4.1 Etablierung Aequorin-basierter Calcium-Influx-Assays 10
4.2 Funktionelle Untersuchung der Pro391 Arg- und der Arg344His-Variante
des h5-HT3A-Rezeptors 10
4.3 Pharmakologische Charakterisierung der putativen 5-HT3C-, 5-HT3D- und
5-HT3E-Rezeptoruntereinheiten 10
B. Material und Methoden 12
I.Material 12
1.1 Arbeitsgeräte 12
1.2 Verbrauchsmaterial 13
1.3 Computer-Software 14
1.4 Kits für die Molekularbiologie 15
1.5 Chemikalien 15
1.6 Radiochemikalien 17
1.7 Strukturformeln der verwendeten 5-HT3-Rezeptorliganden 18
1.8 Nährmedien für die Bakterienkultur 19
1.9 Puffer und Lösungen 19
1.10 Enzyme 21
1.11 Nukleinsäuren 22
1.12 Zelllinien 22
1.13 Vektoren 23
2. Methoden 25
2.1 Zellkulturmethoden 25
2.1.1 Kultivierung von HEK293-Zellen 25
2.1.2 Auftauen der Zellen 25
2.1.3 Mediumwechsel 25
2.1.4 Teilung der Zellkulturen 25
2.1.5 Einfrieren der Zellen 26
2.2 Molekularbiologische Methoden 26
2.2.1 Plasmid Mini-Präparation 26
2.2.2 Plasmid Mega-Präparation 26
2.2.3 DNA-Konzentrationsbestimmung 26
2.2.4 Horizontale Agarose-Gelelektrophorese 27
2.2.5 Isolierung von DNA aus Agarosegelen 28
2.2.6 Reinigung von DNA durch Phenol/Chloroform-Extraktion 28
2.2.7 Fällung von DNA mit Ethanol 28
2.2.8 Polymerasekettenreaktion (PCR) 29
2.2.9 Klonierungstechniken 30
2.2.9.1 Klonierung von PCR-Produkten 30
2.2.9.2 Restriktionsverdau von DNA 30
2.2.9.3 Ligation von DNA-Enden 31
2.2.9.4 Transformation kompetenter Bakterien 31
2.2.9.5 Anlegen von Bakterien-Dauerkulturen 32
2.2.10 DNA-Sequenzierung 32
2.2.11 Transiente Transfektion der Zellen 33
2.3 Biochemische Methoden 34
2.3.1 Proteinbestimmung nach Lowry 34
2.3.2 Proteinbestimmung mit dem DC-Proteinassay (Biorad) 34
2.3.3 Membranpräparation 34
2.4 Pharmakologische Methoden 35
2.4.1 Radioligandbindungsstudien 35
2.4.1.1 Theoretische Grundlagen 35
2.4.1.2 Durchführung der Radioligandbindungsstudien 37
2.4.2 Patch-Clamp Messungen 38
2.4.2.1 Messkonfigurationen 38
2.4.2.2 Versuchsaufbau 39
2.4.2.3 Durchführung der Patch-Clamp Messungen 41
2.4.2.4 Datenanalyse 41
2.4.3 Aequorin-Assays 42
2.4.3.1 Das Photoprotein Aequorin 42
2.4.3.2 Coelenterazin-Analoga 44
2.4.3.3 Durchführung der Aequorin-Assays 45
2.4.3.4 Datenanalyse 46
2.5 Statistische Auswertung 46
C. Ergebnisse 47
1. Etablierung einer Methode der Aequorin-basierten Calcium-Influx-Messung
an rekombinanten 5-HT3-Rezeptoren 47
2. Funktionelle Charakterisierung der natürlichen Rezeptorvarianten h5-HT3A
Pro391 Arg und hö-HT^ Arg^His 53
2.1 Elektrophysiologische Charakterisierung des rekombinanten h5-HT3A
Wildtyp-Rezeptors 55
2.2 Elektrophysiologische Charakterisierung der natürlichen
Rezeptorvariante h5-HT3A Pro391 Arg 56
2.2.1 Aktivierung des 5-HT3-vermittelten Natrium-Einstroms durch die 5-
HT3-Rezeptoragonisten 5-HT, mCPBG und 2-Methyl-5-HT 56
2.2.2 Hemmung des 5-HT-induzierten Natrium-Einstroms durch die 5-HT3-
Rezeptorantagonisten d-Tubocurarin und Azasetron 60
2.3 Funktionelle Charakterisierung der natürlichen Arg^His-Variante des
humanen 5-HT3A-Rezeptors 62
2.3.1 Aktivierung des 5-HT3-Rezeptor-vermittelten Calcium-Einstroms
durch die 5-HT3-Rezeptoragonisten 5-HT und mCPBG 62
2.3.2 Hemmung des 5-HT-induzierten Calcium-Einstroms durch die 5-HTä-
Rezeptorantagonisten Ondansetron und Azasetron 65
2.3.3 Einfluss des Arg344His-Aminosäureaustausches auf den
Maximaleffekt des Serotonins 67
3. Pharmakologische und funktionelle Charakterisierung der putativen 5-HT3C-,
5-HT3D- und 5-HT3E-Rezeptoruntereinheiten 68
3.1 Radioligandbindungsstudien 70
3.1.1 [3H]-GR65630-Bindung der putativen 5-HT3C-, 5-HT3D- und 5-HT3E-
Rezeptoruntereinheiten 70
3.1.2 [3H]-GR65630-Bindung nach Co-Transfektion der 5-HT3A/c-, 5-HT3A/d
-oder 5-HT3A/E-RezeP'oruntereinheiten 70
3.2 Funktionelle Charakterisierung der putativen 5-HT3c-, 5-HT3D- und 5-
HT3E-Rezeptoruntereinheiten 72
3.2.1 Aktivierung des 5-HT3C-, 5-HT3d- und 5-HT3E-vermittelten Calcium-
Influx durch 5-HT 72
3.2.2 Agonist-induzierter Calcium-Influx nach Co-Transfektion der 5-
HT3a/c-, 5-HT3a/d- oder 5-HT3A/E-Rezeptoruntereinheiten 73
3.2.2.1 5-HT- bzw. mCPBG-induzierter Calcium-Influx 73
3.2.2.2 Hemmung des 5-HT-induzierten Calcium-Influx durch die 5-HT3-
Rezeptorantagonisten Ondansetron und Azasetron 75
3.2.2.3 Einfluss der zusätzlichen Expression der 5-HT:sc-, 5-HT3d- und
5-HT3E-Rezeptoruntereinheiten auf den Maximaleffekt des 5-HT 80
D.Diskussion 81
1. Etablierung Aequorin-basierter Calcium-Influx-Assays 81
2. Funktionelle Charakterisierung der h5-HT3APro391Arg- und der h5-
HTaAArg^His-Variante des h5-HT3A-Rezeptors 85
2.1 Funktionelle Charakterisierung des h5-HT:3APro391Arg-Rezeptors 86
2.2 Funktionelle Charakterisierung des hS-HTwW^His-Rezeptors 88
3. Charakterisierung der putativen 5-HT3c-, 5-HT3D- und 5-HT3E-
Rezeptoruntereinheiten 90
E. Zusammenfassung 95
F. Literaturverzeichnis 98
G. Eigene Veröffentlichungen 106
H.Anhang 107
1. Klonierung des genomischen 5'-Bereiches des humanen 5-HTsA-Rezeptors. 107
2. Subklonierung der Promotorfragmente in den pGL3 Basic-Vektor 109 |
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