Identifizierung von Interaktionspartnern des Motorproteins (Prestin, SLC26A5) der äußeren Haarsinneszellen:
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung i
Kapheii Einleitung 3
1.1 Anatomie und Physiologie des Gehörorgans der Mammalia 3
1.1.1 Topographische Anatomie des Innenohres 3
1.1.2 Die Schallaufnahme und ihre Ausbreitung 6
1.1.3 Der cochleäre Verstärker der äußeren Haarsinneszellen 8
1.1.4 Die Elektromotilität der äußeren Haarsinneszellen 8
1.1.5 Das Motorprotein Prestin 9
1.2 Zielsetzung 12
Kapitel 2 MATERIAL UND METHODEN 13
2.1 Material 13
2.1.1 Chemikalien, Biochemikalien, Puffer und Lösungen 13
2.1.2 Zelllinien, Bakterien-und Hefestämme 15
2.1.3 Plasmide 16
2.1.4 Oligodesoxyribonukleotide 16
2.1.5 Antikörper 17
2.1.6 Kits 18
2.2 Molekularbiologische Methoden 19
2.2.1 Gewebepräparationen 19
2.2.2 RNA-Isolation 20
2.2.3 cDNA-Synthese 20
2.2.4 RT-PCR und PCR 20
2.2.5 Ribosondensynthese 21
2.2.6 U jv/«-Hybridisierung 22
2.2.7 3 -RACE 22
2.2.8 Agarose-Gelelektrophorese 23
2.2.9 DNA-Extraktion aus Agarose-Gelen 23
2.2.10 Konzentration-und Reinheitsbestimmung von Nukleinsäure 23
2.2.11 DNA-Verdau mit Restriktionsenzymen 23
2.2.12 Dephosphorylierung von DNA-Enden 23
2.2.13 Iigation und Transformation 24
2.2.14 Ethanol-Fällung 24
2.2.15 Phenol-Chloroform-Fällung 24
2.2.16 Plasmid-DNA-Präparation 24
2.2.17 Dauerkulturen 25
INHALTS^RZEICHNIS
2.3 Zellkultur 25
2.3.1 Kultivierung und Anlegen von HEK-293-Dauerkulturen
(Kryokonservierung) 25
2.3.2 Beschichtung von Glasdeckgläschen mit Poly-L-Lysin 25
2-3.3 Transfektion von HEK-293-Zellen mit rekombinanter DNA 25
2.3.4 ZeÜ2ahlbestimmung 26
2.4 Proteinbiochemische Methoden 26
2.4.1 Proteinextraktionen 26
2.4.2 Proteinbestimmung nach Bradford 27
2-4.3 Immunhistochemie 27
2.4.4 Western Blot und ECL Plus Western £/ö//w£-Detektion 27
2.4.5 In «/TO-Co-Immunpräzipitation 28
2.5 Ycast Two-Hybrid-MtthoAcn 29
2.5.1 Herstellung kompetenter Hefezellen 29
2.5.2 Hefe-Transformation 29
2.5.3 Test auf transkriptioneile Aktivität 29
2.5.4 Transformation von AH109 mit der pAD-GAL4-2.1-cDNA-Bank 30
2.5.5 Verpaarung des Köders mit der pAD-GAL4-2.t-cDNA-Bank 30
2-5.6 Sequenzanalyse der positiven Klone 30
2-5.7 In j/viw-Secjuenz- und Datenbankanalysen 31
Kapitel 3 ERGEBNISSE 32
Problemstellung 32
3.1 Identifizierte Prestin-Interaktionspartner mittels
Massenspektrometrie 33
3.2 Massenspektrometrische Analysen 36
3.2.1 RT-PCR am Cortischen Organ 36
3.2.2 RT-PCR an einzelnen ÄHZ 36
3.2.3 In ^//«-Hybridisiening 37
3.3 Validierung einer Interaktion von Kandidatengenen mit
Prestin 39
3.3.1 Klonierung eines EGFP- und DsRed-getaggten
Vtesttn-JuU-lcHgth-Gens 39
3.3.2 In /»y«-Transfektionsstudien des Presan-^w7-i«r;M-Gens in
HEK-293-Zellen 41
3.3.3 Verifizierung von SPFH2, GLUT1 und RAB10 43
ii
Inhaltsverzeichnis
3.4 Vorbereitung zur Yeast Two-Uybrid-Analyse von
Interaktionspartner 46
3.4.1 Wahl des Prestin-Fragments als Köder im Y2H-System 48
3.4.2 Identifizierung einer neuen Prestin-Isoform (Prestin-9b) mittels
3 -RACE 48
3.4.3 Expression der Prestin-9b-Isoform in AHZ 52
3.4.4 Prestin-9b-Köder 54
3.4.5 Transformation des Presitn-9b-Köders in den AH 109-Hefestamm 55
3.4.6 Transformation von Beute-Konstrukten in den Y187-Hefestamm 55
3.4.7 Selektionsverfallren positiver Interaktionspartner 56
3.4.8 Identifizierung von Falsch-Positiven-Interaktionskandidaten 56
3.5 Yeast Two-Hybrid-Analyse von Prestin-9b Interaktions¬
partnern 59
3.5.1 Durchmusterung der GAL-AD-Fusionsbank 59
3.5.2 Selektion von Kandidaten-Interaktionspartnern zur Interaktions-
validierung 60
3.5.3 Nachweis von SMPX-, GDI2- und CALM1 -mRNA in der
Cochlea und ÄHZ 61
3.5.4 Validierung einer Interaktion von Kandidatengenen mit
Presitn-9b/- /«wgrf 63
3.5.4.1 In w/n*-Expression des Köders 63
3.5.4.2 In w/ro-Expression der Beute-Proteine 65
3.5.5 Validierung einer putativen Interaktion von Prestin-9b mit
Vtesoa-fuU-kngth 67
Kapitel 4 DISKUSSION 70
Kapitels Literatur 75
Danksagung 80
|
| adam_txt |
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung i
Kapheii Einleitung 3
1.1 Anatomie und Physiologie des Gehörorgans der Mammalia 3
1.1.1 Topographische Anatomie des Innenohres 3
1.1.2 Die Schallaufnahme und ihre Ausbreitung 6
1.1.3 Der cochleäre Verstärker der äußeren Haarsinneszellen 8
1.1.4 Die Elektromotilität der äußeren Haarsinneszellen 8
1.1.5 Das Motorprotein Prestin 9
1.2 Zielsetzung 12
Kapitel 2 MATERIAL UND METHODEN 13
2.1 Material 13
2.1.1 Chemikalien, Biochemikalien, Puffer und Lösungen 13
2.1.2 Zelllinien, Bakterien-und Hefestämme 15
2.1.3 Plasmide 16
2.1.4 Oligodesoxyribonukleotide 16
2.1.5 Antikörper 17
2.1.6 Kits 18
2.2 Molekularbiologische Methoden 19
2.2.1 Gewebepräparationen 19
2.2.2 RNA-Isolation 20
2.2.3 cDNA-Synthese 20
2.2.4 RT-PCR und PCR 20
2.2.5 Ribosondensynthese 21
2.2.6 U jv/«-Hybridisierung 22
2.2.7 3'-RACE 22
2.2.8 Agarose-Gelelektrophorese 23
2.2.9 DNA-Extraktion aus Agarose-Gelen 23
2.2.10 Konzentration-und Reinheitsbestimmung von Nukleinsäure 23
2.2.11 DNA-Verdau mit Restriktionsenzymen 23
2.2.12 Dephosphorylierung von DNA-Enden 23
2.2.13 Iigation und Transformation 24
2.2.14 Ethanol-Fällung 24
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2.2.16 Plasmid-DNA-Präparation 24
2.2.17 Dauerkulturen 25
INHALTS^RZEICHNIS
2.3 Zellkultur 25
2.3.1 Kultivierung und Anlegen von HEK-293-Dauerkulturen
(Kryokonservierung) 25
2.3.2 Beschichtung von Glasdeckgläschen mit Poly-L-Lysin 25
2-3.3 Transfektion von HEK-293-Zellen mit rekombinanter DNA 25
2.3.4 ZeÜ2ahlbestimmung 26
2.4 Proteinbiochemische Methoden 26
2.4.1 Proteinextraktionen 26
2.4.2 Proteinbestimmung nach Bradford 27
2-4.3 Immunhistochemie 27
2.4.4 Western Blot und ECL Plus Western £/ö//w£-Detektion 27
2.4.5 In «/TO-Co-Immunpräzipitation 28
2.5 Ycast Two-Hybrid-MtthoAcn 29
2.5.1 Herstellung kompetenter Hefezellen 29
2.5.2 Hefe-Transformation 29
2.5.3 Test auf transkriptioneile Aktivität 29
2.5.4 Transformation von AH109 mit der pAD-GAL4-2.1-cDNA-Bank 30
2.5.5 Verpaarung des Köders mit der pAD-GAL4-2.t-cDNA-Bank 30
2-5.6 Sequenzanalyse der positiven Klone 30
2-5.7 In j/viw-Secjuenz- und Datenbankanalysen 31
Kapitel 3 ERGEBNISSE 32
Problemstellung 32
3.1 Identifizierte Prestin-Interaktionspartner mittels
Massenspektrometrie 33
3.2 Massenspektrometrische Analysen 36
3.2.1 RT-PCR am Cortischen Organ 36
3.2.2 RT-PCR an einzelnen ÄHZ 36
3.2.3 In ^//«-Hybridisiening 37
3.3 Validierung einer Interaktion von Kandidatengenen mit
Prestin 39
3.3.1 Klonierung eines EGFP- und DsRed-getaggten
Vtesttn-JuU-lcHgth-Gens 39
3.3.2 In /»y«-Transfektionsstudien des Presan-^w7-i«r;M-Gens in
HEK-293-Zellen 41
3.3.3 Verifizierung von SPFH2, GLUT1 und RAB10 43
ii
Inhaltsverzeichnis
3.4 Vorbereitung zur Yeast Two-Uybrid-Analyse von
Interaktionspartner 46
3.4.1 Wahl des Prestin-Fragments als Köder im Y2H-System 48
3.4.2 Identifizierung einer neuen Prestin-Isoform (Prestin-9b) mittels
3'-RACE 48
3.4.3 Expression der Prestin-9b-Isoform in AHZ 52
3.4.4 Prestin-9b-Köder 54
3.4.5 Transformation des Presitn-9b-Köders in den AH 109-Hefestamm 55
3.4.6 Transformation von Beute-Konstrukten in den Y187-Hefestamm 55
3.4.7 Selektionsverfallren positiver Interaktionspartner 56
3.4.8 Identifizierung von Falsch-Positiven-Interaktionskandidaten 56
3.5 Yeast Two-Hybrid-Analyse von Prestin-9b Interaktions¬
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3.5.1 Durchmusterung der GAL-AD-Fusionsbank 59
3.5.2 Selektion von Kandidaten-Interaktionspartnern zur Interaktions-
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3.5.3 Nachweis von SMPX-, GDI2- und CALM1 -mRNA in der
Cochlea und ÄHZ 61
3.5.4 Validierung einer Interaktion von Kandidatengenen mit
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Kapitel 4 DISKUSSION 70
Kapitels Literatur 75
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