Charakterisierung der zytotoxischen Aktivität eines voll humanen Antikörpers gegen das epitheliale Zelladhäsionsmolekül EpCAM (CD326):
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2008
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| adam_text | Titel: Charakterisierung der zytotoxischen Aktivität eines voll humanen Antikörpers gegen das epitheliale
Autor: Rumpler, Susanne Alexandra
Jahr: 2008
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG 1
1.1 Zytotoxische Aktivität von IgG Antikörpern 3
1.2 Epitheliales Zelladhäsionsmolekül EpCAM (CD326) 6
1.3 Antikörper in der Krebstherapie 9
2 MATERIAL 12
2.1 Zelllinien 12
2.2 Antikörper und Analysensysteme 13
2.3 Medien, Lösungen und Reagenzien 14
2.3.1 Reagenzien für Zellkultur 14
2.3.2 Puffer 14
2.3.3 Chemikalien 16
2.4 Verbrauchsmaterial 17
2.5 Gerate 17
2.6 Software 18
3 METHODEN 19
3.1 Zellkultur 19
3.1.1 Einfrieren und Auftauen 19
3.1.2 Kultivierung von Zellen 19
3.1.3 Zellzahlbestimmung 20
3.2 Präparation von Effektorzellen und Humanserum 21
3.2.1 Isolierung von PBMC 21
3.2.2 Präparation von PBMC-Subpopulationen mit dem MACS-System 22
3.2.2.1 Isolierung von NK-Zellen mit CDS6 MicroBeads 22
3.2.2.2 Isolierung von Monozyten mit dem Monocyte Isolation Kit 23
3.2.3 Bestimmung des Anteils von PBMC-Subpopulationen 24
3.2.4 Präparation von Humanserum 24
3.3 Durchflußzytometeranalysen 25
3.3.1 Immunfluoreszenz, Einschrittfärbung 25
3.3.2 Immunfluoreszenz, Zweischrittfärbung 25
3.3.3 Quantifizierung der Antigenexpression mit dem QUIFIKIT 26
3.3.4 Bestimmung der Bindungskonstante 27
3.3.5 Kompetitionsstudien 28
29.
3.4 Zytotoxizitätsanalysen
3.4.1 Komplement-abhängige Zytotoxizität (CDC) 29
3.4.1.1 FACS-basierte CDC Analyse ^
3.4.1.2 Fluorometer-basierte CDC Analyse
3.4.2 Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) 30
3.4.2.1 FACS-basierte ADCC Analyse 31
3 5 Protein A Affinitätschromatographie zur Abtrennung von IgG 32
3.6 FITC-Markierung des HD69 Antikörpers JJ
3.7 Western Blot Analyse der p44/p42 Expression 33
l ERGEBNISSE M
4.1 Bindungscharakteristika von HD69 35
4.1.1 Spezifrtät für das humane EpCAM Antigen 35
4.1.2 Bestimmung der Bindungskonstante 37
4.2 Komplement-abhängige Zytotoxizität (CDC) 38
4.2.1 Spezifität der CDC 38
4.2.2 Kinetik der CDC-Reaktion 41
4.2.3 Serumspendervariabilität
4.3 Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) 43
4.3.1 Spezifität der ADCC M
4.3.2 Kinetik der ADCC-Reaktion 46
4.3.3 PBMC-Donorvariabilität 48
4.3.4 Analyse des Wirkungsmechanismus
4.3.4.1 Isolation ADCC-relevanter PBMC-Subpopulationen (Monozyten, NK-
Zellen) 51
4.3.4.2 Aktivierung von p44/42 (Erk) in Natürlichen Killerzellen 0J
4.4 Analyse der CDC und ADCC von HD69 und Trastuzumab gegenüber
Brustkarzinomzelllinien
4.4.1 Analyse der EpCAM und HER-2 Expression ^
4.4.2 Analyse der CDC 60
4.4.3 Untersuchung der Expression von Komplementresistenzfaktoren 61
4.4.4 Analyse der ADCC 63
4.4.5 Untersuchung der MHC Klasse I Expression 71
4.5 Untersuchung des Einflusses von endogenem Serum IgG auf die ADCC-
Aktivität von HD69 und Trastuzumab (Serumeffekt) 75
4.5.1 Inhibition der ADCC-Aktivität durch Humanserum 76
4.5.2 Bnfluss von Antigendichte und Zelllinie auf den inhibitorischen Effekt
von Serum 77
4.5.3 Einfluss des PBMC-Spenders auf den inhibitorischen Effekt von
Serum 79
4.5.4 Abhängigkeit des inhibitorischen Effekts von im Serum enthaltenen
IgG 81
4.5.5 Kompetition von Serum IgG und HD69 um die Bindung an CD16
bzw. EpCAM 83
5 DISKUSSION 86
5.1 Charakterisierung des Anti-EpCAM Antikörpers HD69 86
5.1.1 Mögliche Vorteile der moderaten Affinität von HD69 für EpCAM 86
5.1.2 Die Wirkmechanismen von HD69 87
5.1.3 Analyse der ADCC-relevanten Effektorzellpopulationen 88
5.2 CDC und ADCC von HD69 und Trastuzumab gegenüber
Brustkarzinomzelllinien 90
5.2.1 Voraussetzungen für CDC 91
5.2.2 Strategien zur Verbesserung der CDC-Aktivität 93
5.2.3 Targetzellspezifische Faktoren, die die ADCC-Aktivität von HD69
beeinflussen 94
5.2.4 Die Rolle der MHC Klasse I Expression für die Antikörper¬
unabhängige und die Antikörper-abhängige Zytotoxizitätsreaktion 96
5.2.5 Strategien zur Verbesserung der ADCC-Aktivität 98
5.3 Der Einfluss von Serum IgG auf die ADCC-Aktivität therapeutischer Antikörperi00
6 ZUSAMMENFASSUNG 104
7 LITERATUR 105
|
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Titel: Charakterisierung der zytotoxischen Aktivität eines voll humanen Antikörpers gegen das epitheliale
Autor: Rumpler, Susanne Alexandra
Jahr: 2008
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG 1
1.1 Zytotoxische Aktivität von IgG Antikörpern 3
1.2 Epitheliales Zelladhäsionsmolekül EpCAM (CD326) 6
1.3 Antikörper in der Krebstherapie 9
2 MATERIAL 12
2.1 Zelllinien 12
2.2 Antikörper und Analysensysteme 13
2.3 Medien, Lösungen und Reagenzien 14
2.3.1 Reagenzien für Zellkultur 14
2.3.2 Puffer 14
2.3.3 Chemikalien 16
2.4 Verbrauchsmaterial 17
2.5 Gerate 17
2.6 Software 18
3 METHODEN 19
3.1 Zellkultur 19
3.1.1 Einfrieren und Auftauen 19
3.1.2 Kultivierung von Zellen 19
3.1.3 Zellzahlbestimmung 20
3.2 Präparation von Effektorzellen und Humanserum 21
3.2.1 Isolierung von PBMC 21
3.2.2 Präparation von PBMC-Subpopulationen mit dem MACS-System 22
3.2.2.1 Isolierung von NK-Zellen mit CDS6 MicroBeads 22
3.2.2.2 Isolierung von Monozyten mit dem Monocyte Isolation Kit 23
3.2.3 Bestimmung des Anteils von PBMC-Subpopulationen 24
3.2.4 Präparation von Humanserum 24
3.3 Durchflußzytometeranalysen 25
3.3.1 Immunfluoreszenz, Einschrittfärbung 25
3.3.2 Immunfluoreszenz, Zweischrittfärbung 25
3.3.3 Quantifizierung der Antigenexpression mit dem QUIFIKIT 26
3.3.4 Bestimmung der Bindungskonstante 27
3.3.5 Kompetitionsstudien 28
29.
3.4 Zytotoxizitätsanalysen
3.4.1 Komplement-abhängige Zytotoxizität (CDC) 29
3.4.1.1 FACS-basierte CDC Analyse ^
3.4.1.2 Fluorometer-basierte CDC Analyse
3.4.2 Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) 30
3.4.2.1 FACS-basierte ADCC Analyse 31
3 5 Protein A Affinitätschromatographie zur Abtrennung von IgG 32
3.6 FITC-Markierung des HD69 Antikörpers JJ
3.7 Western Blot Analyse der p44/p42 Expression 33
l ERGEBNISSE M
4.1 Bindungscharakteristika von HD69 35
4.1.1 Spezifrtät für das humane EpCAM Antigen 35
4.1.2 Bestimmung der Bindungskonstante 37
4.2 Komplement-abhängige Zytotoxizität (CDC) 38
4.2.1 Spezifität der CDC 38
4.2.2 Kinetik der CDC-Reaktion 41
4.2.3 Serumspendervariabilität
4.3 Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) 43
4.3.1 Spezifität der ADCC M
4.3.2 Kinetik der ADCC-Reaktion 46
4.3.3 PBMC-Donorvariabilität 48
4.3.4 Analyse des Wirkungsmechanismus
4.3.4.1 Isolation ADCC-relevanter PBMC-Subpopulationen (Monozyten, NK-
Zellen) 51
4.3.4.2 Aktivierung von p44/42 (Erk) in Natürlichen Killerzellen 0J
4.4 Analyse der CDC und ADCC von HD69 und Trastuzumab gegenüber
Brustkarzinomzelllinien "
4.4.1 Analyse der EpCAM und HER-2 Expression ^
4.4.2 Analyse der CDC 60
4.4.3 Untersuchung der Expression von Komplementresistenzfaktoren 61
4.4.4 Analyse der ADCC 63
4.4.5 Untersuchung der MHC Klasse I Expression 71
4.5 Untersuchung des Einflusses von endogenem Serum IgG auf die ADCC-
Aktivität von HD69 und Trastuzumab (Serumeffekt) 75
4.5.1 Inhibition der ADCC-Aktivität durch Humanserum 76
4.5.2 Bnfluss von Antigendichte und Zelllinie auf den inhibitorischen Effekt
von Serum 77
4.5.3 Einfluss des PBMC-Spenders auf den inhibitorischen Effekt von
Serum 79
4.5.4 Abhängigkeit des inhibitorischen Effekts von im Serum enthaltenen
IgG 81
4.5.5 Kompetition von Serum IgG und HD69 um die Bindung an CD16
bzw. EpCAM 83
5 DISKUSSION 86
5.1 Charakterisierung des Anti-EpCAM Antikörpers HD69 86
5.1.1 Mögliche Vorteile der moderaten Affinität von HD69 für EpCAM 86
5.1.2 Die Wirkmechanismen von HD69 87
5.1.3 Analyse der ADCC-relevanten Effektorzellpopulationen 88
5.2 CDC und ADCC von HD69 und Trastuzumab gegenüber
Brustkarzinomzelllinien 90
5.2.1 Voraussetzungen für CDC 91
5.2.2 Strategien zur Verbesserung der CDC-Aktivität 93
5.2.3 Targetzellspezifische Faktoren, die die ADCC-Aktivität von HD69
beeinflussen 94
5.2.4 Die Rolle der MHC Klasse I Expression für die Antikörper¬
unabhängige und die Antikörper-abhängige Zytotoxizitätsreaktion 96
5.2.5 Strategien zur Verbesserung der ADCC-Aktivität 98
5.3 Der Einfluss von Serum IgG auf die ADCC-Aktivität therapeutischer Antikörperi00
6 ZUSAMMENFASSUNG 104
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