Molekularbiologische Untersuchungen zur Gelenkknorpelwundheilung in vitro:
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1 einleitung 9
1.1 Gelenkknorpelwundheilung in vitro 9
/././ Gelenkknorpelverletzung 9
1.1.2 Der Wachstumsfaktor GDF-5 11)
1.1.3 Die Wachstumsfaktoren Insulin und Testosteron //
12 MolekularbiologischeUntersuchungen 13
1.2.1 Die Polymerasekettenrcaktion 13
1.2.2 Reaktionsprinzip der PCR 13
1.2.3 Weiterentwicklung der PCR 16
1.2.3.1 RT-PCR 16
1.2 3.2 Real-time RT-PCR 17
1.2.4 RNA-lsnliervng aus Knorpelgewehe 19
1 2.4. | Methoden der RNA-Isolierang 19
¦ 1 2.4.2 Möglichkeiten der Homogenisierung 21
1.2.5 Primerdesign und weitere Reaktionskomponenten der PCR 23
1.3 Zielsetzung 24
1.3.1 Entwicklung einer effizienten Methode der RNA-Gewinnung. 24
1.3.2 Entwicklung ivm bovinen Primemßirdie RT-PCR 25
1.3.3 Erzeugung von externen Standards für die absolute Quantifizierung von Knorpel-mRUA 25
1.4 EXPERIMENTELLE FRAGESTELLUNG 26
1.4.1 Ein/Juss des Wachstumsfaktors GDF-5 auf Zellmatrixkonslrukte 26
1.4.2 Einfluss der Wachstumsfaktoren Insulin und Testasteron auf die knorpelspezifische
Genexpression des nativen Gelenkknorpels und dessen Zellmatrixkonstrukte 26
2 material. 27
2.1 Probenmaterial 27
2.2 chemikalien und reagenzien 27
2.2.1 Chemikalien fiir die RNA-Isolierung. 27
2.2.2 Chemikalien für die Reverse-Transkriplase (cDNA-Synthese) 27
2.2.3 Chemikalien für die Polymerase-Kettenreaktion 27
2.2.4 Chemikalien fiir die Sequenzierung und Erzeugung von Slandardkurven 2S
2.2.5 Reagenzien für die Gelelektrophorese. 2H
2.3 VERWENDETE ARBEITSMATERIALIEN UND GERÄTE 29
3 MF.THPPEN 31
3.1 Gewinnung der Knorpelproben 31
3.1.1 Probenpräparation und Geometrie 31
3.1.2 Kultivierung. 32
3.2 Molekül arb iologische Verfahren 33
3.2.1 Voraussetzungenför die Durchfiihrung der RNA-Gewinnung und der RT-PCR 33
3.2.2 RNA-Gewinnung 34
3.2.2.1 StandardmethodedetRNA-Isolierung 34
3.2.2.2 Versuche zur Homogenisierung 35
3.2 2,3 Wirkungsweise der Geräte zur Homogenisierung 37
3.2.3 Quantifizierung der RNA -tO
3.2.4 cDNA-Synthese 41
3.2.5 Real-time PCR im LighiCycter -H
3.2.5.1 Aufbau und Funktion des LightCycler Instruments 42
3.2.5.2 Verwendung von SYBR Green 1 zum Nachweis der PCR-Produkte 44
3.2.5.3 Quantitative PCR im LightCycler 45
3.2.5.4 Durchführung der LightCycler RT-PCR 47
3.2.6 Entwicklung der Primer 49
3.2.6.1 Auswahl der Primersequenzen 49
3.2.6.2 Primerkonzentration 50
3.2.6.3 Annealingtemperatur, Elongations2eit und Magnesiumchlorid-Konzentration 50
3.2.7 Detektion und Analyse der PCR-Produkte Sl
3.2.7.1 Gelelektrophorese 51
3.2.7.2 Amplikonsequenzierung 52
3.2.8 Generierung der Standards und der externen Standardkurven $3
4 ergebnisse 55
4.1 Versuche zur RNA-Gewinnung 55
4.1.1 Effektivität des Xenox Homogenisators und der Gefriertrocknung. 55
4.1.2 Effektivität der Gefriertrocknung und des Ullraturrax. 56
4.2 PRIMER FÜR DIE RT-PCR 61
4.2.1 Auswahl der Primersequenzen 61
4.2.2 Annealingtemperatur, Elungationszeit und Magnesiumchlorid-Konzentration 63
4.3 Kontrolle der Primerspezifität 74
4.3.1 Geletektrophorese 74
4.3.2 Amplikonsequenzierung 77
4.4 Standardkurvenerzeugung 77
4.5 ElNFLUSS VON GDF-5 AUF ZELLMATRIXKONSTRUKTE 81
4 6 ElNFLUSS VON INSULIN UND TESTOSTERON AUF NATIVEN UND TE KNORPEL 84
5 diskussion .....„.»..».«.«...„.„....«.«..«.».«.»..».»»«...«»».«».«..««»...»»».»»„»„,.«„...., 87
5.1 rna-gewinnung 87
5.2 entwicklung der bovinenprimer 90
5.3 Die absolute Quantifiz[erung über externe Standards und die Normalisierung 92
5.4 Effekt von GDF-5 im Tissue Engineering von Knorpel 93
5.5 EFFEKT WNlNSULfNl/NDTESTOSTERONAUFNArrVENUNDTE KNORPEL 96
6 ZIJSAMMENFASSÜNGb-.»..-.™„«.».».h.»....-.«.««.«.h«.».»-.-.-.-.-.«....™«h»-«m--.-«..»m.«.99
7 LITERATURVERZEICHNIS 101
8 ANHANG».»....»».«.».......».«..».»,...«.».«...*.».»..»».««.».».»«««».».»««»»»«.»«.««.«. III
8 1 DOKTORANDENVERTRAG 111
8.2 PUBLIKATIONEN ) 13
R.2.l Synergistic effects nfgrnwlh and development factor-5 (GDF-5) and insulin an primary and
expanded chondrocytes in a 3-D envirnnmenl 113
X.2.2 Hormonal effects on nalive and ti.ssue cngineered articular cartilage Integration 139
DANKSAGUNG .»««.»».».«...»«„»»»«»«»»..».«.»»«»«.«».«.»»»»».».»..».»».««««««• 141
LEBENSLAUF 142
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Inhaltsverzeichnis
1 einleitung 9
1.1 Gelenkknorpelwundheilung in vitro 9
/././ Gelenkknorpelverletzung 9
1.1.2 Der Wachstumsfaktor GDF-5 11)
1.1.3 Die Wachstumsfaktoren Insulin und Testosteron //
12 MolekularbiologischeUntersuchungen 13
1.2.1 Die Polymerasekettenrcaktion 13
1.2.2 Reaktionsprinzip der PCR 13
1.2.3 Weiterentwicklung der PCR 16
1.2.3.1 RT-PCR 16
1.2 3.2 Real-time RT-PCR 17
1.2.4 RNA-lsnliervng aus Knorpelgewehe 19
1 2.4. | Methoden der RNA-Isolierang 19
¦ 1 2.4.2 Möglichkeiten der Homogenisierung 21
1.2.5 Primerdesign und weitere Reaktionskomponenten der PCR 23
1.3 Zielsetzung 24
1.3.1 Entwicklung einer effizienten Methode der RNA-Gewinnung. 24
1.3.2 Entwicklung ivm bovinen Primemßirdie RT-PCR 25
1.3.3 Erzeugung von externen Standards für die absolute Quantifizierung von Knorpel-mRUA 25
1.4 EXPERIMENTELLE FRAGESTELLUNG 26
1.4.1 Ein/Juss des Wachstumsfaktors GDF-5 auf' Zellmatrixkonslrukte 26
1.4.2 Einfluss der Wachstumsfaktoren Insulin und Testasteron auf die knorpelspezifische
Genexpression des nativen Gelenkknorpels und dessen Zellmatrixkonstrukte 26
2 material. 27
2.1 Probenmaterial 27
2.2 chemikalien und reagenzien 27
2.2.1 Chemikalien fiir die RNA-Isolierung. 27
2.2.2 Chemikalien für die Reverse-Transkriplase (cDNA-Synthese) 27
2.2.3 Chemikalien für die Polymerase-Kettenreaktion 27
2.2.4 Chemikalien fiir die Sequenzierung und Erzeugung von Slandardkurven 2S
2.2.5 Reagenzien für die Gelelektrophorese. 2H
2.3 VERWENDETE ARBEITSMATERIALIEN UND GERÄTE 29
3 MF.THPPEN 31
3.1 Gewinnung der Knorpelproben 31
3.1.1 Probenpräparation und Geometrie 31
3.1.2 Kultivierung. 32
3.2 Molekül arb iologische Verfahren 33
3.2.1 Voraussetzungenför die Durchfiihrung der RNA-Gewinnung und der RT-PCR 33
3.2.2 RNA-Gewinnung 34
3.2.2.1 StandardmethodedetRNA-Isolierung 34
3.2.2.2 Versuche zur Homogenisierung 35
3.2 2,3 Wirkungsweise der Geräte zur Homogenisierung 37
3.2.3 Quantifizierung der RNA -tO
3.2.4 cDNA-Synthese 41
3.2.5 Real-time PCR im LighiCycter -H
3.2.5.1 Aufbau und Funktion des LightCycler Instruments 42
3.2.5.2 Verwendung von SYBR Green 1 zum Nachweis der PCR-Produkte 44
3.2.5.3 Quantitative PCR im LightCycler 45
3.2.5.4 Durchführung der LightCycler RT-PCR 47
3.2.6 Entwicklung der Primer 49
3.2.6.1 Auswahl der Primersequenzen 49
3.2.6.2 Primerkonzentration 50
3.2.6.3 Annealingtemperatur, Elongations2eit und Magnesiumchlorid-Konzentration 50
3.2.7 Detektion und Analyse der PCR-Produkte Sl
3.2.7.1 Gelelektrophorese 51
3.2.7.2 Amplikonsequenzierung 52
3.2.8 Generierung der Standards und der externen Standardkurven $3
4 ergebnisse 55
4.1 Versuche zur RNA-Gewinnung 55
4.1.1 Effektivität des Xenox Homogenisators und der Gefriertrocknung. 55
4.1.2 Effektivität der Gefriertrocknung und des Ullraturrax. 56
4.2 PRIMER FÜR DIE RT-PCR 61
4.2.1 Auswahl der Primersequenzen 61
4.2.2 Annealingtemperatur, Elungationszeit und Magnesiumchlorid-Konzentration 63
4.3 Kontrolle der Primerspezifität 74
4.3.1 Geletektrophorese 74
4.3.2 Amplikonsequenzierung 77
4.4 Standardkurvenerzeugung 77
4.5 ElNFLUSS VON GDF-5 AUF ZELLMATRIXKONSTRUKTE 81
4 6 ElNFLUSS VON INSULIN UND TESTOSTERON AUF NATIVEN UND TE KNORPEL 84
5 diskussion .„.».».«.«.„.„.«.«.«.».«.».».»»«.«»».«».«.««».»»».»»„»„,.«„., 87
5.1 rna-gewinnung 87
5.2 entwicklung der bovinenprimer 90
5.3 Die absolute Quantifiz[erung über externe Standards und die Normalisierung 92
5.4 Effekt von GDF-5 im Tissue Engineering von Knorpel 93
5.5 EFFEKT WNlNSULfNl/NDTESTOSTERONAUFNArrVENUNDTE KNORPEL 96
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7 LITERATURVERZEICHNIS 101
8 ANHANG».».»».«.».».«.».»,.«.».«.*.».».»».««.».».»«««».».»««»»»«.»«.««.«. III
8 1 DOKTORANDENVERTRAG 111
8.2 PUBLIKATIONEN ) 13
R.2.l Synergistic effects nfgrnwlh and development factor-5 (GDF-5) and insulin an primary and
expanded chondrocytes in a 3-D envirnnmenl 113
X.2.2 Hormonal effects on nalive and ti.ssue cngineered articular cartilage Integration 139
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