Einfluss der Prozessivität der Reversen Transkriptase des humanen Immundefizienzvirus Typ I auf die G-zu-A Mutationsrate induziert durch APOBEC3-Proteine:
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| adam_text | Titel: Einfluss der Prozessivität der reversen Transkriptase des humanen Immundefizienzvirus Typ I auf die
Autor: Knöpfel, Stefanie Andrea
Jahr: 2008
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung___________________________________________________1
1.1 Das humane Immundefizienz Virus____________.....................................1
1.2 Pathogenese und Klinik der HIV-1 Infektion______________________2
1.3 Genetische Variabilitiät von HIV-1______________________.................3
1.4 Die antiretrovirale Therapie und Resistenz-assoziierte Mutationen____4
1.5 Die reverse Transkription__________..................._________________.... 5
1.6 Prozessivität von Varianten der HTV-1 Reversen Transkriptase______7
1.7 Viral infectivity factor (Vif) und seine Interaktion mit Apolipoprotein B
mRNA-editing enzyme, catalytic Polypeptide 3 (APOBEC3)-Proteinen.__8
2 Zielsetzung..................................................................12
3 Material und Methoden.............................................13
3.1 Reagenzien--------.-------.--------------------.__...............________............13
3.2 Puffer, Lösungen und Medien...................______._____.------..._____14
3.3 Enzyme und Antikörper.______________.........................____«..._____15
J**T mVUII* UI vi £1CUC 1V119 ????????????????*???????¦??????????*?????????????????*??????*? ???? ¦*????¦???????????? X v
3.5 Oligonukleotide--------------------------------------------------------------------16
3.6 Plasmide___________________________________________________18
3.7 Nachweis und Analyse von DNA_____...__..............._______________19
3.7.1 Agarose-Gelelektrophorese...........................................................................19
3.7.2 DNA-Präparation durch freeze squeeze.....................................................20
3.7.3 Bestimmung der Konzentration und Reinheit von DNA...............................20
3.8 Polymerase-Ketten-Reaktion....________________________________21
3.8.1 Quantitative real-time PCR...........................................................................22
3.8.2 Allel-spezifische real-time PCR....................................................................23
3.8.3 Schmelzkurven-Analyse................................................................................23
I
Inhaltsverzeichnis
3.8.4 DNA-Sequenzierung......................................................................................24
3.9 Methoden zur RNA- und DNA-Präparation------------------.....................24
3.9.1 Präparation von Plasmid-DNA......................................................................24
3.9.2 PCR-Aufreinigung.........................................................................................25
3.9.3 Isolierung genomischer DNA........................................................................25
3.9.4 Isolierung gesamtzellulärer RNA..................................................................25
3.9.5 Isolierung viraler RNA..................................................................................26
3.9.6 Synthese von cDNA.......................................................................................26
3.10 Zielgerichtete DNA-Mutagenese................................................................26
3.10.1 Zweistufige PCR-Mutagenese.......................................................................26
3.10.2 Orts-gerichtete Mutagenese...........................................................................27
3.11 Klonierung von DNA-Fragmenten................................__.____.........___28
3.11.1 Restriktion von DNA-Fragmenten.................................................................28
3.11.2 Dephosphorylierung und Ligation von DNA-Fragmenten............................29
3.12 Nutzung von Bakterien.................................................................___...... 29
3.12.1 Kultivierung und Lagerung von Bakterien....................................................29
3.12.2 Herstellung von Transformations-kompetenten Zellen.................................30
3.12.3 Transformation durch Hitzeschock................................................................30
3.12.4 Screening der Bakterienklone........................................................................30
3.13 Eukaryotische Zelen_________________________________________31
3.13.1 Kultivierung von eukaryotischen Zellen........................................................31
3.13.2 Isolierung und Kultivierung von peripheral blood mononuclear cells.........31
3.13.3 Zellzählung und Vitalitätsbestimmung..........................................................31
3.13.4 Transiente Transfektion von 293T-Zellen.....................................................32
3.13.5 Kryokonservierung und Auftauen von eukaryotischen Zellen......................32
3.14 Virusstock-Charakterisierung__________________________________33
3.14.1 Virusanzucht zur Herstellung infektiöser Stock-Lösungen...........................33
3.14.2 HIV-1 p24 Antigen-ELISA...........................................................................33
3.15 Infektion eukaryotischer Zellen mit HTV-1_______________________34
3.15.1 Bestimmung der Permissivität.......................................................................34
3.15.2 Bestimmung der G-zu-A Mutationsrate in HTV-1 DNA...............................34
3.16 Statistische Datenauswertung_______,___________________________35
n
Inhaltsverzeichnis
4 Ergebnisse...................................................................37
4.1 Replikationsverhalten von HIV-1 NL4-3 und HIV-1 NL4-3Avif
Varianten in T-ZeUlinien und PBMCs___________________________37
4.2 APOBEC3G mRNA Gehalt in H9 Zellen ist höher verglichen mit
PBMCs vier verschiedener Spender..........._______________________39
4.3 Keine Unterschiede in der viralen Mutationsrate in Abhängigkeit von
der RT-Variante in Anwesenheit von Vif________._________._______40
4.4 Env-Fragmente aus HIV-1 NL4-3Avif Mi84i infizierten H9 Zellen zeigen
erhöhte G-zu-A Mutationsraten.__.______________________............... 43
4.5 Keine Unterschiede in den G-zu-A Mutationsraten in nef und 3 LTR aus
infizierten H9 Zellen bezüglich der HTV-1 NL4-3Avif RT Varianten__46
4.6 Env-Fragmente aus HIV-1 NL4-3AvjfMi84i und HTV-1 NL4-
3AvifK65R/Mi84v infizierten PBMCs zeigen erhöhte G-zu-A
Mutationsraten.___________..______............................________..........48
4.7 Die Analyse des Dinukleotid-Kontextes in env und nef+3 LTR zeigt
präferentielle G-zu-A Transitionsstellen.............__..____________....... 51
5 Diskussion...................................................................53
6 Zusammenfassung......................................................60
7 Literaturverzeichnis...................................................62
8 Ab kürzungs Verzeichnis..............................................70
9 Danksagung................................................................72
10 Erklärung...................................................................73
in
Inhaltsverzeichnis
11 Lebenslauf..................................................................74
IV
|
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Titel: Einfluss der Prozessivität der reversen Transkriptase des humanen Immundefizienzvirus Typ I auf die
Autor: Knöpfel, Stefanie Andrea
Jahr: 2008
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung_1
1.1 Das humane Immundefizienz Virus_.1
1.2 Pathogenese und Klinik der HIV-1 Infektion_2
1.3 Genetische Variabilitiät von HIV-1_.3
1.4 Die antiretrovirale Therapie und Resistenz-assoziierte Mutationen_4
1.5 Die reverse Transkription_._. 5
1.6 Prozessivität von Varianten der HTV-1 Reversen Transkriptase_7
1.7 Viral infectivity factor (Vif) und seine Interaktion mit Apolipoprotein B
mRNA-editing enzyme, catalytic Polypeptide 3 (APOBEC3)-Proteinen._8
2 Zielsetzung.12
3 Material und Methoden.13
3.1 Reagenzien--------.-------.--------------------._._.13
3.2 Puffer, Lösungen und Medien._._.------._14
3.3 Enzyme und Antikörper._._«._15
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3.6 Plasmide_18
3.7 Nachweis und Analyse von DNA_._._19
3.7.1 Agarose-Gelelektrophorese.19
3.7.2 DNA-Präparation durch freeze squeeze.20
3.7.3 Bestimmung der Konzentration und Reinheit von DNA.20
3.8 Polymerase-Ketten-Reaktion._21
3.8.1 Quantitative real-time PCR.22
3.8.2 Allel-spezifische real-time PCR.23
3.8.3 Schmelzkurven-Analyse.23
I
Inhaltsverzeichnis
3.8.4 DNA-Sequenzierung.24
3.9 Methoden zur RNA- und DNA-Präparation------------------.24
3.9.1 Präparation von Plasmid-DNA.24
3.9.2 PCR-Aufreinigung.25
3.9.3 Isolierung genomischer DNA.25
3.9.4 Isolierung gesamtzellulärer RNA.25
3.9.5 Isolierung viraler RNA.26
3.9.6 Synthese von cDNA.26
3.10 Zielgerichtete DNA-Mutagenese.26
3.10.1 Zweistufige PCR-Mutagenese.26
3.10.2 Orts-gerichtete Mutagenese.27
3.11 Klonierung von DNA-Fragmenten._._._28
3.11.1 Restriktion von DNA-Fragmenten.28
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3.12 Nutzung von Bakterien._. 29
3.12.1 Kultivierung und Lagerung von Bakterien.29
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3.12.3 Transformation durch Hitzeschock.30
3.12.4 Screening der Bakterienklone.30
3.13 Eukaryotische Zelen_31
3.13.1 Kultivierung von eukaryotischen Zellen.31
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3.13.4 Transiente Transfektion von 293T-Zellen.32
3.13.5 Kryokonservierung und Auftauen von eukaryotischen Zellen.32
3.14 Virusstock-Charakterisierung_33
3.14.1 Virusanzucht zur Herstellung infektiöser Stock-Lösungen.33
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3.15.1 Bestimmung der Permissivität.34
3.15.2 Bestimmung der G-zu-A Mutationsrate in HTV-1 DNA.34
3.16 Statistische Datenauswertung_,_35
n
Inhaltsverzeichnis
4 Ergebnisse.37
4.1 Replikationsverhalten von HIV-1 NL4-3 und HIV-1 NL4-3Avif
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4.2 APOBEC3G mRNA Gehalt in H9 Zellen ist höher verglichen mit
PBMCs vier verschiedener Spender._39
4.3 Keine Unterschiede in der viralen Mutationsrate in Abhängigkeit von
der RT-Variante in Anwesenheit von Vif_._._40
4.4 Env-Fragmente aus HIV-1 NL4-3Avif Mi84i infizierten H9 Zellen zeigen
erhöhte G-zu-A Mutationsraten._._. 43
4.5 Keine Unterschiede in den G-zu-A Mutationsraten in nef und 3'LTR aus
infizierten H9 Zellen bezüglich der HTV-1 NL4-3Avif RT Varianten_46
4.6 Env-Fragmente aus HIV-1 NL4-3AvjfMi84i und HTV-1 NL4-
3AvifK65R/Mi84v infizierten PBMCs zeigen erhöhte G-zu-A
Mutationsraten._._._.48
4.7 Die Analyse des Dinukleotid-Kontextes in env und nef+3'LTR zeigt
präferentielle G-zu-A Transitionsstellen._._. 51
5 Diskussion.53
6 Zusammenfassung.60
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