Regulation des humanen GILZ-Promotors durch Clostridium difficile Toxin B:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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2008
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|---|---|
| adam_text | Titel: Regulation des humanen GILZ-Promotors durch Clostridium difficile Toxin B
Autor: Göppel, David
Jahr: 2008
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG
1.1 Effekte und Funktionsprinzip von Glukokortikoiden 5
1.2 GILZ 6
1.3 Das Bakterium Yersinia enterocolitica 8
1.4 Funktionsprinzip kleiner GTPasen und Einfluss
bakterieller Zytotoxine auf Rho GTPasen 9
1.5 Induktion von GILZ durch die Rho GTPase Inhibitoren
YopT und Clostridium difficile Toxin B 14
1.6 Der humane GlLZ-Promotor 15
1.7 Charakteristik der wichtigsten GILZ-Promotor Elemente 17
1.8 Zielsetzung der Arbeit 20
2 MATERIAL UND METHODEN
2.1 Materialien
2.1.1 Geräte 21
2.1.2 Chemikalien 22
2.1.3 Antikörper 24
2.1.4 Verbrauchsmittel 25
2.1.5 Kommerzielle Kits 26
2.1.6 Größenstandards 27
2.1.7 Enzyme 27
2.1.8 Zelllinien 28
2.1.9 Medien 28
2.1.10 Bakterienstämme 28
2.1.11 Bakterien-Nährmedien 29
2.1.12 Pufferund Lösungen 30
2.1.12.1 Antibiotika-Lösungen 30
2.1.12.2 Allgemeine Puffer 30
2.1.13 Synthetische Oligonukleotide 32
1
Inhaltsverzeichnis
2.1.14 Vektoren 34
2.2 Methoden
2.2.1 Molekularbiologische Methoden
2.2.1.1 Präparation von Plasmiden 36
2.2.1.2 Agarosegelelektrophorese 36
2.2.1.3 DNA-Konzentrationsbestimmung 37
2.2.1.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 38
2.2.1.5 Restriktionsspaltung von DNA 38
2.2.1.6 Ligation von DNA-Fragmenten 39
2.2.1.7 Austausch von Nukleotiden in DNA 39
2.2.1.8 Sequenzierung 42
2.2.2 Proteinchemische und allgemein biochemische Methoden
2.2.2.1 SDS-Polyacrylamidgelektrophorese (SDS-PAGE) 42
2.2.2.2 Westernblot mit Immunodetektion 44
2.2.2.3 Proteinbestimmung nach Bradford 47
2.2.3 Arbeiten mit Bakterien
2.2.3.1 Herstellung Ca2*-kompetenter E. coli DH5a 47
2.2.3.2 Transformation nach der CaCI2-Hitzeschock-Methode 48
2.2.3.3 Konservierung von Bakterienstämmen 48
2.2.4 Arbeiten mit eukaryontischen Zellen
2.2.4.1 Kultivierung und Lagerung von Gewebskulturzellen
2.2.4.1.1 Kultivierung von Gewebskulturzellen 49
2.2.4.1.2 Auftauen von Gewebskulturzellen 49
2.2.4.1.3 Einfrieren von Gewebskulturzellen 50
2.2.4.2 Bestimmung der Lebendzellzahl mit Trypan-Blau 50
2.2.4.3 Transiente Transfektion von HeLa Zellen 51
2.2.4.4 Evaluation der Transfektion 53
2.2.4.4.1 Luziferase-Assay 53
2.2.4.4.2 ß-Galaktosidase-Assay 53
2.2.4.5 Isolierung von Kernextrakten und Zytosolen 54
2
Inhaltsverzeichnis
3 ERGEBNISSE
3.1 Vorarbeiten Asselin-Labat era/., 2004 56
3.2 Clostridium difficile Toxin B induziert GILZ-Protein-Expression 60
3.3 Untersuchung der transkriptioneilen Regulation des
GILZ-Promotors durch Clostridium difticile Toxin B
3.3.1 Clostridium difficile Toxin B und Dexamethason
erhöhen die transkriptionelle Aktivität des
GILZ-Promotors 61
3.3.2 Das proximale GILZ-Promotorfragment GILZ p416
ist ausreichend für Clostridium difficile Toxin B
vermittelte GILZ-Expression 63
3.4 Herstellung von GILZ-Promotor Mutanten mittels site-directed
Mutagenese 65
3.4.1 Ergebnis der Sequenzanalyse nach Mutagenese
der GILZ-Promotor-Mutanten 67
3.4.2 Herstellung der GILZ p1940 c-myc 1+2 mut und
GILZ p1940Oct-1a+b Doppelmutanten 69
3.4.3 Ergebnis der Sequenzanalyse nach Herstellung
derGILZ-Promotor-Doppelmutanten 70
3.5 Das GILZ-Promotorelemet c-myc 1 ist essentiell für
Clostridium difficile Toxin B vermittelte GILZ-Induktion 71
3.6 Unter Clostridium difficile Toxin B Stimulation kommt es zu
keiner gesteigerten Expression der Transkriptionsfaktoren
c-Myc oder USF-2 74
3.7 GILZ-Induktion durch Clostridium difficile Toxin B wird nicht
durch c-Myc vermittelt 76
3.8 USF-2 ist ein starker Induktor der GILZ-Expression 77
3.9 Die USF-2 induzierte GILZ-Expression ist
konstitutiv und unspezifisch 78
3
Inhaltsverzeichnis
4 DISKUSSION 81
4.1 Das GILZ-Promotorelement c-myc 1 ist essentiell für die
Closthdium difficile Toxin B vermittelte GILZ-Induktion 84
4.2 USF-2 induziert stark, aber unspezifisch GILZ 85
5 ZUSAMMENFASSUNG 89
6 ABKÜRZUNGEN 91
7 LITERATURVERZEICHNIS 94
8 DANKSAGUNG 107
9 LEBENSLAUF 108
4
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Titel: Regulation des humanen GILZ-Promotors durch Clostridium difficile Toxin B
Autor: Göppel, David
Jahr: 2008
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG
1.1 Effekte und Funktionsprinzip von Glukokortikoiden 5
1.2 GILZ 6
1.3 Das Bakterium Yersinia enterocolitica 8
1.4 Funktionsprinzip kleiner GTPasen und Einfluss
bakterieller Zytotoxine auf Rho GTPasen 9
1.5 Induktion von GILZ durch die Rho GTPase Inhibitoren
YopT und Clostridium difficile Toxin B 14
1.6 Der humane GlLZ-Promotor 15
1.7 Charakteristik der wichtigsten GILZ-Promotor Elemente 17
1.8 Zielsetzung der Arbeit 20
2 MATERIAL UND METHODEN
2.1 Materialien
2.1.1 Geräte 21
2.1.2 Chemikalien 22
2.1.3 Antikörper 24
2.1.4 Verbrauchsmittel 25
2.1.5 Kommerzielle Kits 26
2.1.6 Größenstandards 27
2.1.7 Enzyme 27
2.1.8 Zelllinien 28
2.1.9 Medien 28
2.1.10 Bakterienstämme 28
2.1.11 Bakterien-Nährmedien 29
2.1.12 Pufferund Lösungen 30
2.1.12.1 Antibiotika-Lösungen 30
2.1.12.2 Allgemeine Puffer 30
2.1.13 Synthetische Oligonukleotide 32
1
Inhaltsverzeichnis
2.1.14 Vektoren 34
2.2 Methoden
2.2.1 Molekularbiologische Methoden
2.2.1.1 Präparation von Plasmiden 36
2.2.1.2 Agarosegelelektrophorese 36
2.2.1.3 DNA-Konzentrationsbestimmung 37
2.2.1.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 38
2.2.1.5 Restriktionsspaltung von DNA 38
2.2.1.6 Ligation von DNA-Fragmenten 39
2.2.1.7 Austausch von Nukleotiden in DNA 39
2.2.1.8 Sequenzierung 42
2.2.2 Proteinchemische und allgemein biochemische Methoden
2.2.2.1 SDS-Polyacrylamidgelektrophorese (SDS-PAGE) 42
2.2.2.2 Westernblot mit Immunodetektion 44
2.2.2.3 Proteinbestimmung nach Bradford 47
2.2.3 Arbeiten mit Bakterien
2.2.3.1 Herstellung Ca2*-kompetenter E. coli DH5a 47
2.2.3.2 Transformation nach der CaCI2-Hitzeschock-Methode 48
2.2.3.3 Konservierung von Bakterienstämmen 48
2.2.4 Arbeiten mit eukaryontischen Zellen
2.2.4.1 Kultivierung und Lagerung von Gewebskulturzellen
2.2.4.1.1 Kultivierung von Gewebskulturzellen 49
2.2.4.1.2 Auftauen von Gewebskulturzellen 49
2.2.4.1.3 Einfrieren von Gewebskulturzellen 50
2.2.4.2 Bestimmung der Lebendzellzahl mit Trypan-Blau 50
2.2.4.3 Transiente Transfektion von HeLa Zellen 51
2.2.4.4 Evaluation der Transfektion 53
2.2.4.4.1 Luziferase-Assay 53
2.2.4.4.2 ß-Galaktosidase-Assay 53
2.2.4.5 Isolierung von Kernextrakten und Zytosolen 54
2
Inhaltsverzeichnis
3 ERGEBNISSE
3.1 Vorarbeiten Asselin-Labat era/., 2004 56
3.2 Clostridium difficile Toxin B induziert GILZ-Protein-Expression 60
3.3 Untersuchung der transkriptioneilen Regulation des
GILZ-Promotors durch Clostridium difticile Toxin B
3.3.1 Clostridium difficile Toxin B und Dexamethason
erhöhen die transkriptionelle Aktivität des
GILZ-Promotors 61
3.3.2 Das proximale GILZ-Promotorfragment GILZ p416
ist ausreichend für Clostridium difficile Toxin B
vermittelte GILZ-Expression 63
3.4 Herstellung von GILZ-Promotor Mutanten mittels "site-directed"
Mutagenese 65
3.4.1 Ergebnis der Sequenzanalyse nach Mutagenese
der GILZ-Promotor-Mutanten 67
3.4.2 Herstellung der GILZ p1940 c-myc 1+2 mut und
GILZ p1940Oct-1a+b Doppelmutanten 69
3.4.3 Ergebnis der Sequenzanalyse nach Herstellung
derGILZ-Promotor-Doppelmutanten 70
3.5 Das GILZ-Promotorelemet c-myc 1 ist essentiell für
Clostridium difficile Toxin B vermittelte GILZ-Induktion 71
3.6 Unter Clostridium difficile Toxin B Stimulation kommt es zu
keiner gesteigerten Expression der Transkriptionsfaktoren
c-Myc oder USF-2 74
3.7 GILZ-Induktion durch Clostridium difficile Toxin B wird nicht
durch c-Myc vermittelt 76
3.8 USF-2 ist ein starker Induktor der GILZ-Expression 77
3.9 Die USF-2 induzierte GILZ-Expression ist
konstitutiv und unspezifisch 78
3
Inhaltsverzeichnis
4 DISKUSSION 81
4.1 Das GILZ-Promotorelement c-myc 1 ist essentiell für die
Closthdium difficile Toxin B vermittelte GILZ-Induktion 84
4.2 USF-2 induziert stark, aber unspezifisch GILZ 85
5 ZUSAMMENFASSUNG 89
6 ABKÜRZUNGEN 91
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9 LEBENSLAUF 108
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