Nachweis des Leptinrezeptors in proximalen und distalen humanen Tubuluszellen:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2008
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis VI
1. Einleitung 1
1.1 Adipositas, Hypertonie und kardiovaskuläre Folgeerkrankungen 1
1.2Leptin 3
1.2.1 Ätiologie der Adipositas - Die Rolle von Leptin 3
1.2.2 Leptin und Hypertonie 5
1.2.3 Das Hormon Leptin - Biochemische Grundlagen 7
1.3 Der Leptinrezeptor 8
1.3.1 Die kurzen Leptinrezeptor-Varianten 9
1.3.2 Die lange Leptinrezeptor-Variante 9
1.3.3 Die JAK-STAT-Kaskade 11
1.4 Fragestellung der vorliegenden Arbeit 12
2. Material 13
2.1 Geräte und Zubehör 13
2.2 Verbrauchsmaterialien 14
2.3 Chemikalien, Enzyme, Medien, Mediensupplemente 14
2.4 Lösungen 16
3. Methoden 18
3.1 Nierengewebe 18
3.2 Isolationsmethoden 18
3.2.1 Enzymatische Andauung 18
3.2.2 Percoll Dichtegradient 19
3.2.3 Primärantikörper 20
3.2.4 Magnetic Cell Sorting (MACS) 21
3.3 Zellkultivierung 23
3.3.1 Materialien 23
3.3.2 Beschichtung der Kulturgefäße 23
3.3.3 Kultivierung humaner Tubuluszellen 23
3.3.4 Subkultivierung adhärenter Zellen 24
3.3.5 Kryokonservierung und Auftauen von Zellen 24
3.3.6 Zellzählung und Cytotoxizitätsbestimmung mit Trypanblau 24
3.3.7 LDH-Messung als Cytotoxizitätsmarker 25
3.3.8 Steriltests 25
3.4 Isolierung von RNS aus Monolayerkulturen 26
3.4.1 Bestimmung der RNS-Konzentration 27
3.4.2 Isolierung der Poly(A RNS 27
3.5 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 27
3.5.1 Reverse Transkriptase-PCR (RT-PCR) 28
3.5.2 PCRundcDNS 29
3.5.3 Detektion und Analyse des PCR-Produktes 30
3.6 Western Blot 31
3.6.1 Stimulation der Tubuluszellen 31
3.6.2 Probenvorbereitung 31
3.6.3 Proteinbestimmung nach Lowry 32
3.6.4 Denaturierende SDS-Polyacrylamidelektrophorese (SDS-PAGE) 32
3.6.5 Blotting 34
3.6.6 Immundetektion 34
3.7 Immunhistochemie 35
3.71 Gefrierschnitte 35
3.7.2 Antikörper 36
3.7.3 APAAP-Methode 36
3.7.4 Mikroskopische Auswertung 37
4. Ergebnisse 38
4.1 Etablierung der Zellisolation und Zellkultivierung 38
4.2 In vitro Nachweis von mRNS-Expression der
Leptinrezeptor-Isoformen in proximalen und distalen Tubuluszellen 41
4.3 Nachweis und Stimulation des Leptinrezeptors
auf Translationsebene 44
4.4 Etablierung der Immunhistochemie 46
4.4.1 In vivo Nachweis der Leptinrezeptorexpression
in humanen Tubuluszellen 46
4.5 Nachweis der Signaltransduktion 49
5. Diskussion 51
6. Zusammenfassung 58
7. Summary 60
8. Literaturverzeichnis 62
9. Danksagung 73
Lebenslauf 74
EHRENWÖRTLICHE ERKLÄRUNG 75
|
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Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis VI
1. Einleitung 1
1.1 Adipositas, Hypertonie und kardiovaskuläre Folgeerkrankungen 1
1.2Leptin 3
1.2.1 Ätiologie der Adipositas - Die Rolle von Leptin 3
1.2.2 Leptin und Hypertonie 5
1.2.3 Das Hormon Leptin - Biochemische Grundlagen 7
1.3 Der Leptinrezeptor 8
1.3.1 Die kurzen Leptinrezeptor-Varianten 9
1.3.2 Die lange Leptinrezeptor-Variante 9
1.3.3 Die JAK-STAT-Kaskade 11
1.4 Fragestellung der vorliegenden Arbeit 12
2. Material 13
2.1 Geräte und Zubehör 13
2.2 Verbrauchsmaterialien 14
2.3 Chemikalien, Enzyme, Medien, Mediensupplemente 14
2.4 Lösungen 16
3. Methoden 18
3.1 Nierengewebe 18
3.2 Isolationsmethoden 18
3.2.1 Enzymatische Andauung 18
3.2.2 Percoll Dichtegradient 19
3.2.3 Primärantikörper 20
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3.3 Zellkultivierung 23
3.3.1 Materialien 23
3.3.2 Beschichtung der Kulturgefäße 23
3.3.3 Kultivierung humaner Tubuluszellen 23
3.3.4 Subkultivierung adhärenter Zellen 24
3.3.5 Kryokonservierung und Auftauen von Zellen 24
3.3.6 Zellzählung und Cytotoxizitätsbestimmung mit Trypanblau 24
3.3.7 LDH-Messung als Cytotoxizitätsmarker 25
3.3.8 Steriltests 25
3.4 Isolierung von RNS aus Monolayerkulturen 26
3.4.1 Bestimmung der RNS-Konzentration 27
3.4.2 Isolierung der Poly(A RNS 27
3.5 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 27
3.5.1 Reverse Transkriptase-PCR (RT-PCR) 28
3.5.2 PCRundcDNS 29
3.5.3 Detektion und Analyse des PCR-Produktes 30
3.6 Western Blot 31
3.6.1 Stimulation der Tubuluszellen 31
3.6.2 Probenvorbereitung 31
3.6.3 Proteinbestimmung nach Lowry 32
3.6.4 Denaturierende SDS-Polyacrylamidelektrophorese (SDS-PAGE) 32
3.6.5 Blotting 34
3.6.6 Immundetektion 34
3.7 Immunhistochemie 35
3.71 Gefrierschnitte 35
3.7.2 Antikörper 36
3.7.3 APAAP-Methode 36
3.7.4 Mikroskopische Auswertung 37
4. Ergebnisse 38
4.1 Etablierung der Zellisolation und Zellkultivierung 38
4.2 In vitro Nachweis von mRNS-Expression der
Leptinrezeptor-Isoformen in proximalen und distalen Tubuluszellen 41
4.3 Nachweis und Stimulation des Leptinrezeptors
auf Translationsebene 44
4.4 Etablierung der Immunhistochemie 46
4.4.1 In vivo Nachweis der Leptinrezeptorexpression
in humanen Tubuluszellen 46
4.5 Nachweis der Signaltransduktion 49
5. Diskussion 51
6. Zusammenfassung 58
7. Summary 60
8. Literaturverzeichnis 62
9. Danksagung 73
Lebenslauf 74
EHRENWÖRTLICHE ERKLÄRUNG 75 |
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