Etablierung eines Kupfertransportassays für das Morbus-Wilson-Protein ATP7B im Baculovirussystem und Nachweis des defekten Kupfertransports durch ATP7B-Mutanten:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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2008
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| adam_text | Titel: Etablierung eines Kupfertransportassays für das Morbus-Wilson-Protein ATP7B im Baculovirussystem un
Autor: Toth, Nana Vanessa
Jahr: 2008
INHALTSVERZEICHNIS
Abkürzungen 6
1. Einleitung 8
1.1 Morbus Wilson: Pathogenese und Klinik 8
1.2 Diagnostik und Therapie 9
1.3 ATP7B: Struktur und Funktion 10
1.4 Mutationen im ATP7B-Gen 13
1.5 Baculovirus-Expressionssystem 15
1.6 Fragestellung 16
2. Material 17
2.1 Bezugsquellen 17
2.1.1 Chemikalien und Reagenzien 17
2.1.2 Enzyme und Antikörper 17
2.1.3 Kits (Chemikalien-Zusammensetzungen) 17
2.1.4 Verbrauchsmaterial 17
2.1.5 Geräte 17
2.2 Medien und Zusätze 18
2.3 Puffer 19
2.4 Oligonukleotide 20
2.5 Vektor 21
2.6 Bakterienstämme 22
2.7 Zelllinie 22
3. Methoden 23
3.1 Baculovirus-Expressionssystem 23
3.2 Polymerase-Kettenreaktion 24
3.3 Ortsgerichtete Mutagenese 25
3.4 Agarosegelelektrophorese 26
3.5 Isolierung und Reinigung von DNA aus Agarosegelen 26
3.6 Enzymatische Spaltung von DNA (Restriktionsverdau) 27
3.7 Ligation 27
3
3.8 Herstellung kompetenter Bakterienzellen 27
3.9 Transformation 28
3.10 Isolation von Plasmiden 28
3.11 Restriktionsanalyse der isolierten Klone 28
3.12 Photometrische Konzentrations- und Reinheitsprüfung 29
3.13 Sequenzierung 29
3.14 Herstellung rekombinanter Baculovirus-DNA 29
3.15 Isolation von Bacmiden 30
3.16 Kultivierung von Sf9-Insektenzellen 30
3.17 Einfrieren und Auftauen von Zellen 31
3.18 Transfektion 31
3.19 Ernte und Lagerung von Baculoviren 32
3.20 Virustiterbestimmung 32
3.21 Infektion und Proteinexpression 33
3.22 Präparation einer totalen Membranfraktion 33
3.23 Bestimmung der Proteinkonzentration 34
3.24 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese 34
3.25 Western Blot 35
3.26 Transportexperiment mit 64Cu 35
4. Ergebnisse 38
4.1 Klonierungvonyi7P75 38
4.2 Ortsgerichtete Mutagenese des^(7P75-Gens 39
4.3 Herstellung rekombinanter Baculovirus-DNA 40
4.4 Herstellung von Baculoviren 41
4.5 Überexpression in Sf9-Insektenzellen 41
4.6 Transportexperiment mit 64Cu 43
5. Diskussion 49
5.1 Kupfertransport durch ATP7B im Baculovirussystem 49
5.2. Funktionelle Untersuchungen der ATP7B-Mutationen T1031S und H1069Q 50
5.3 Ausblick 52
5.3.1 Pathogenetische Bedeutung neu entdeckter Mutationen imATP7B-Gen 52
5.3.2 Untersuchung funktioneller Domänen von ATP7B 53
4
5.3.3 ATP7B und Platinresistenz maligner Tumoren 54
5.3.4 Offene Fragen 54
6. Zusammenfassung 56
7. Literaturverzeichnis 60
Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit
Lebenslauf
Danksagung
5
|
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Titel: Etablierung eines Kupfertransportassays für das Morbus-Wilson-Protein ATP7B im Baculovirussystem un
Autor: Toth, Nana Vanessa
Jahr: 2008
INHALTSVERZEICHNIS
Abkürzungen 6
1. Einleitung 8
1.1 Morbus Wilson: Pathogenese und Klinik 8
1.2 Diagnostik und Therapie 9
1.3 ATP7B: Struktur und Funktion 10
1.4 Mutationen im ATP7B-Gen 13
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1.6 Fragestellung 16
2. Material 17
2.1 Bezugsquellen 17
2.1.1 Chemikalien und Reagenzien 17
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2.1.4 Verbrauchsmaterial 17
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2.2 Medien und Zusätze 18
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2.6 Bakterienstämme 22
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3. Methoden 23
3.1 Baculovirus-Expressionssystem 23
3.2 Polymerase-Kettenreaktion 24
3.3 Ortsgerichtete Mutagenese 25
3.4 Agarosegelelektrophorese 26
3.5 Isolierung und Reinigung von DNA aus Agarosegelen 26
3.6 Enzymatische Spaltung von DNA (Restriktionsverdau) 27
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3
3.8 Herstellung kompetenter Bakterienzellen 27
3.9 Transformation 28
3.10 Isolation von Plasmiden 28
3.11 Restriktionsanalyse der isolierten Klone 28
3.12 Photometrische Konzentrations- und Reinheitsprüfung 29
3.13 Sequenzierung 29
3.14 Herstellung rekombinanter Baculovirus-DNA 29
3.15 Isolation von Bacmiden 30
3.16 Kultivierung von Sf9-Insektenzellen 30
3.17 Einfrieren und Auftauen von Zellen 31
3.18 Transfektion 31
3.19 Ernte und Lagerung von Baculoviren 32
3.20 Virustiterbestimmung 32
3.21 Infektion und Proteinexpression 33
3.22 Präparation einer totalen Membranfraktion 33
3.23 Bestimmung der Proteinkonzentration 34
3.24 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese 34
3.25 Western Blot 35
3.26 Transportexperiment mit 64Cu 35
4. Ergebnisse 38
4.1 Klonierungvonyi7P75 38
4.2 Ortsgerichtete Mutagenese des^(7P75-Gens 39
4.3 Herstellung rekombinanter Baculovirus-DNA 40
4.4 Herstellung von Baculoviren 41
4.5 Überexpression in Sf9-Insektenzellen 41
4.6 Transportexperiment mit 64Cu 43
5. Diskussion 49
5.1 Kupfertransport durch ATP7B im Baculovirussystem 49
5.2. Funktionelle Untersuchungen der ATP7B-Mutationen T1031S und H1069Q 50
5.3 Ausblick 52
5.3.1 Pathogenetische Bedeutung neu entdeckter Mutationen imATP7B-Gen 52
5.3.2 Untersuchung funktioneller Domänen von ATP7B 53
4
5.3.3 ATP7B und Platinresistenz maligner Tumoren 54
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